16例中途胚胎植入前遗传学诊断/筛查病例报道及文献复习

目的 探讨中途胚胎植入前遗传学诊断/筛查(Midway PGD/PGS)发生原因、结局及可行性,为今后临床实践提供依据和参考.方法 对1例Midway PGD/PGS过程进行详细报道,总结16例相似病例结局,复习文献,分析MidwayPGD/PGS与计划PGD/PGS不同之处及可能的影响.结果 西北妇女儿童医院于2014年1月至2017年4月期间共完成16例Midway PGD/PGS,活检57个冷冻复苏囊胚,回报非整倍体胚胎31个、整倍体胚胎24个、无信号胚胎2个,可用胚胎率42.1％;共解冻移植13周期,结果未孕6周期、自然流产1周期、继续妊娠4周期、足月产2周期,临床妊娠率53.8％.Midway PGD/PGS与计划PGD/PGS相比在操作程序有诸多不同,其中IVF受精、囊胚打孔及反复冻融等操作现有指南未涉及,目前尚无指导性建议.结论 Midway PGD/PGS中IVF受精、反复冻融步骤可能影响PGD准确率和胚胎进一步发育潜能,如何评价其效果有待进一步积累经验.

3种疱疹科病毒DNA提取方法的建立

采用HSV1、HSV2和HCMV 3种疱疹科病毒的病毒细胞培养液,用冻融法、煮沸法、蛋白酶K法、NP40(乙基苯基聚乙二醇)法、综合法及改良通用法提取病毒DNA.综合法是将3种病毒细胞培养混合物各2ml,2500r/min离心10min,用2ml冷PBS缓冲液溶解沉淀,1200r/min离心5min,用1ml胰酶(0.25%)溶解沉淀,50℃保温18h,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25241),3000r/min离心10min,取水相加入1/2体积7.5mol/L的NH4(AC),2倍无水乙醇,-20℃放置30min,10000r/min离心10min,沉淀用70%乙醇洗涤,干燥,溶于50μl TE缓冲液.改良的通用法是在综合法基础上于提取前将病毒细胞液反复冻融3次,3000r/min离心40min纯化病毒;采用蛋白酶K(100μg/ml)38℃消化30min;4℃沉淀DNA时,18000r/ml离心20min;其余步骤同综合法.

不同种属来源明胶及其他因素对明胶酶谱法检测金属蛋白酶的影响

金属蛋白酶-2(MMP-2,明胶酶A)与金属蛋白酶-9(MMP-9,明胶酶B)在多种生理过程中起作用,病理状态下如肿瘤、心血管疾病和呼吸系统疾病,则这些酶的表达和活性增加[1-2].明胶酶谱法多用于检测血浆、细胞培养上清及组织中的金属蛋白酶-2和9的活性[3],我们先前的实验发现不同来源的明胶直接影响明胶酶谱法结果,不同方式处理样本对酶的活性检测有影响,本研究就明胶的来源(自猪、牛皮肤提取)是否影响金属蛋白酶活性的检测,以及不同样本量、样本储存温度、反复冻融等因素对明胶酶谱法检测金属蛋白酶活性的影响进行探讨.

9种WADA禁用生长激素释放肽和生长激素促分泌素的HPLC-MS/MS检测及尿中稳定性研究

目的:选取世界反兴奋剂机构(WADA)禁用的7种生长激素释放肽(GHRP-1,GHRP-2,GHRP-4,GHRP-5,GHRP-6,Hexarelin和Alexamorelin)和2种生长激素促分泌素(Anamorelin和Ipamorelin)为研究对象,建立人尿中的HPLC-MS/MS检测方法,进行稳定性实验.方法:使用Oasis(R)WCX固相提取小柱(1cc,30rmg)对尿样进行化学前处理,尿样加入内标后离心,取1mL加入小柱,依次用5％ NH4OH和20％ CH3CN清洗后,用含2％甲酸的水/乙腈(1/3)洗脱液洗脱,35℃氮气流下吹干,复溶后进样于LC-MS/MS.使用1290/6470液相色谱质谱仪和Zorbax 300SB-C18色谱柱进行定性分析,流动相采用含0.2％甲酸的水/乙腈体系.结果:检测限根据不同物质分布在0.01～0.5 ng/mL(S/N＞3).回收率分布在40％～76％之间,日内精密度和日间精密度均小于15％,尿中基质无明显干扰.室温,冷藏条件储存和反复冻融对Anamorelin、GHRP-2、GHRP-4和GHRP-5有明显影响.结论:建立了尿中9种生长激素释放肽和生长激素促分泌素的HPLC-MS/MS检测方法,方法简单,特异性、灵敏度均可满足WADA实验室国际标准和技术文件要求.现已应用于我实验室的常规检测.尿样在传送、检测及实验室长期保存过程中应尽量避免反复冻融.

大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究

目的 为了在大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因.方法 根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性,设计搭桥引物,并通过PCR扩增法合成了人β防御素的全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体.将表达载体转化E.coli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达.将菌体反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白. 融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割.结果 研究得到了重组人防御素蛋白,琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,抑菌效价为0 .843 U. 结论人β防御素-3基因在大肠杆菌中得到了融合表达.

试剂反复冻融对乙型肝炎病毒核酸检测结果的影响

血浆(清)乙型肝炎病毒(HBV)DNA含量是乙肝感染者病毒复制的直接指标.HBV DNA定量检测结果的准确性直接关系到乙肝感染者病毒复制水平、抗病毒药物疗效、肝移植术后HBV复发感染.为保证HBV DNA定昔检测结果的准确性,对HBV DNA试剂的贮藏和运输均要求较高,运输与贮藏的任一环节的不当均会影响试剂的临床使用质量[1].在实际临床工作中,HBV DNA的PCR试剂在每次配制过程中,试剂已融解但还有剩余留待下次的现象十分普遍.本文就反复冻融试剂利用实时荧光定量PCR技术检测HBV DNA含量来评价其对检测结果的影响.

反复冻融处理同种异体移植兔跟腱组织学及生物力学变化

背景:近年来反复冻融处理技术作为一种同种异体肌腱的保存处理方法,主要原理是反复利用0～-60℃腱细胞易损伤的冷冻温度,使得肌腱内细胞无活性,从而降低免疫原性.目的:拟观察反复冻融处理对同种异体移植兔跟腱组织学和生物力学的影响.设计、时间及地点:组织形态学及生物力学水平的对照动物实验,于2007-10/2008-02在北京大学运动医学研究所实验室完成.材料:选用17只成年健康新西兰大白兔.方法:无菌条件下取兔跟腱并带0.6 cm×0.4 cm跟骨骨块,按照组织库程序行60Co照射68 min,照射剂量为25 kGy.分为3组,-80 ℃冷冻,室温融解,反复冻融次数分别是1,3和10次,每组又抽取7条肌腱作生物力学测定,4条作组织学观察.主要观察指标:取肌腱行苏木精-伊红染色、胶原Van Gieson染色和透射电镜扫描,观察跟腱组织形态学改变,并进行跟腱拉伸实验以观察生物力学变化.结果:组织学观察发现,随着反复冻融次数的增加,腱束和胶原纤维捧列变得混乱直至断裂,细胞崩解,并且由于冰晶形成造成明显的腱束间裂隙.生物力学方面,与冻融1次组比较,冻融3,10次组的大载荷、大载荷能量及大应力均显著降低(P<0.05),其他指标如弹性模量、能量密度也有下降但不明显.结论:反复冻融处理肌腱是一种有创的处理方法,正如组织学表现的可以引起细胞崩解、腱纤维紊乱甚至断裂等,终会导致其生物力学水平的下降.

超声破碎及反复冻融收集脂肪间充质干细胞裂解液的优条件

背景:旁分泌在间充质干细胞治疗方面起主要作用.提取间充质干细胞裂解液,可以避免直接间充质干细胞本身所致栓塞、肿瘤以及免疫排斥反应等问题,然而目前提取间充质干细胞裂解液的方法存在差异.目的:比较超声破碎及反复冻融方法获得间充质干细胞裂解液的差异.方法:①从健康的人腹部皮下脂肪中分离出脂肪间充质干细胞,经贴壁筛选法纯化细胞,胎牛血清培养基体外培养扩增,并采用流式细胞检测仪鉴定其常用表面标记;②采用反复冻融及超声细胞破碎2种破壁方法,将1×109 L-1,2×109 L-1,4×109 L-13种不同密度的细胞分别置于生理盐水与双蒸水中进行破碎,比较细胞破碎率及裂解液蛋白含量的差异.结果与结论:①通过体外分离人体脂肪组织,可获得脂肪间充质干细胞;②细胞裂解时,细胞浓度越高,破壁所需时间越长,而破碎时间越长,则细胞破碎率越大;③生理盐水中超声细胞破碎法得到的蛋白含量较其他条件高;④结果提示在生理盐水环境下使用超声方法提取脂肪间充质干细胞裂解液尤为有效,且推荐细胞浓度为4×109 L-1以内.

反复冻融与超高压处理制备脱细胞组织工程血管支架的实验研究

目的 观察不同浓度核酸酶对经反复冻溶加超高压处理后兔股动脉的脱细胞效果.方法 无菌条件下采取新鲜兔股动脉,去血管外膜后将材料分为未处理组、冻融组、超高压处理组、冻融+超高压处理,后三组分别于-80℃冷冻2 h、37℃水浴复温15 min,上述冻融过程反复进行3次.5000大气压超高压(4℃)处理20min将供体来源细胞压碎,结合不同浓度核酸酶进行消化,脱去残留细胞碎片形成脱细胞血管支架.通过组织学和超微结构观察,对不同浓度核酸酶脱细胞效果进行评价,测定反复冻融加超高压处理对血管材料生物力学特性的影响.结果 组织学显示,经反复冻溶加超高压处理后的血管材料,可在较短的时间内被较低浓度核酸酶除去血管支架内的供体细胞成分,脱细胞支架的主要生物力学性能指标与正常血管相比,无明显改变.结论 反复冻溶加超高压脱细胞方法可以明显缩短脱细胞血管基质的制备周期,为脱细胞组织工程血管支架的快速高效制备提供一种新的思路和方法.

血清反复冻融对肿瘤标志物浓度的影响

在检验临床和科研工作中,经常要对血清标本进行冻存,以备日后检测或复查.在血清肿瘤标志物(Tumor marker,TM)检测中,试剂厂商一般都提醒用户避免反复冻融血清,并建议对血清进行分装冻存."血清反复冻融会影响结果"似乎已成为共识.问题是影响程度有多大?导致结果升高还是降低?少见国内外相关研究报道.因此,我们在严格质量控制前提下进行了本试验,结果显示,几个TM浓度在血清冻融三次后并未发生明显变化.

4种治疗方法对尖锐湿疣疗效的比较

临床资料： 250例尖锐湿疣，其中男性 209例，女性 41例；年龄 19～ 63岁；病程 15天～ 1年。 治疗方法： A组 (微波治疗组 )60例，局部常规消毒后，用利多卡因局麻，脚控开关控制在 3～ 5秒，仪器功率调至 40～ 50mA，用辐射器头垂直接触疣体，较大皮损可插入疣体，使其凝固发白或发出“噼叭”声。 B组 (多功能电离子手术组 )60例，局部常规消毒，局麻后用长火档逐层烧灼碳化至基底部。 C组 (液氮冰冻治疗组 )80例，用棉签蘸液氮直接接触加压至疣体结冰发白，反复冻融 3～ 4次。 D组 (“疣脱欣”治疗组 )50例，由医护人员给患者外涂药液，每次涂 3～ 4遍，至疣体表面发白，每日上、下午各治疗 1次， 3天为 1疗程。各组均于治疗后 1周、半个月、 1个月、 2个月、 3个月复诊，观察疗效及复发情况，后统计疗效。 疗效判断标准：痊愈：经一次性治疗 (“疣脱欣”为一疗程 )皮疹全部消失，无复发；显效：皮疹消除 70％以上或复发者作第 2次治疗后皮疹消失，无复发；有效：皮疹消除 30％以上，或复发者进行第 3次治疗后皮疹消失；无效：皮疹消除 30％以下或多次复发。 结果： A组：痊愈 49例 (82％ )，显效 9例 (15％ )，有效率 97％。 B组：痊愈 45例 (75％ )，显效 12例 (20％ )，有效率 95％。两组间有效率无显著性差异 (χ 2=0.2087,P >0.5)。 C组：痊愈 37例 (46.3％ )，显效 20例 (25％ )，有效率 71.3％，和 A组有显著性差异 (χ 2=15.10,P<0.005)。 D组：痊愈 24例 (48％ )，显效 13例 (26％ )，有效率 74％，和 A组有显著性差异 (χ 2="11.90,P<" 0.05)。而 C组和 D组间则无显著性差异 (χ 2="11.90,P<" 0.05)。

重组人生长激素脂质体的制备及载药研究

目的 采用乙醇注入法结合反复冻融技术制备重组人生长激素脂质体,并考察影响包封率的主要因素.方法 采用乙醇注入法制备空白脂质体,并通过反复冻融载药,采用葡聚糖凝胶柱分离结合CBB G-250染色法测定游离药物含量,计算包封率;考察孵化时间、孵化温度、冻融次数对包封率的影响;对冻干制品的外观、复溶速度、粒径及分布进行综合评分,优选冻干支持剂.结果 孵化时间为40 min、孵化温度为10℃、冻融次数为3次时,能够获得较高包封率的脂质体,包封率为63.59%.海藻糖在脂质体冷冻干燥过程中具有好的保护作用.结论 乙醇注入法结合反复冻融可用于大分子蛋白质类脂质体的制备.

全血抽提基因组DNA数量与纯度影响因素的探讨

目的研究全血标本在反复冻融后对抽提基因组DNA数量和纯度的影响.方法本研究随机抽取100份样本,相隔24小时连续进行反复冻融四次,将每次融化的样本抽提基因组DNA,并用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度.结果全血样本反复冻融组间比较抽提基因组DNA的数量检测结果比较提示均有显著差异(P＜0.01),但纯度反复冻融组间比较的检测结果提示均无统计学意义(P＞0.05).结论反复冻融对全血标本抽提基因组DNA的数量有使其下降的作用,对纯度则无影响.

冰冻保存M-H琼脂的质量评价

目的 评价冰冻(-20℃)保存对M-H琼脂培养基的质量效果及有效期.方法 1将预先制好并经灭菌后的M-H琼脂培养基置于-20℃保存,在1月、3月、6月、1年、2年后取出,隔水加热浇制成平板,用标准质控菌株做质量监测;2将预先制好并经灭菌后的M-H琼脂培养基置于-20℃保存,1个月后取出,加热融解浇制一部分平板后再冰冻2天,如此反复6次,每次均用标准质控菌株来鉴定其质量.结果 1用标准质控菌株鉴定各期限冰冻保存的M-H琼脂培养基的质量,均与新鲜时一样,用丁胺卡那霉素或庆大霉素药敏试纸监测的抑菌圈直径均符合质量控制鉴定标准.2用标准质控菌株鉴定反复冻融6次以内的M-H琼脂培养基的质量均与新鲜时一样,均符合质量控制鉴定标准.结论 冰冻保存不影响M-H琼脂培养基的质量,其有效期长达2年,且可反复冻融6次,该保存法适用于基层医院,也为商品化批量生产提供了长期保存方式,值得推广应用.

血清样本反复冻融对甲状腺功能相关实验室指标检测结果的影响

目的:研究血清样本反复冻融对甲状腺功能相关实验室指标(TT3、TT4、TSH、FT3、FT4)检测结果的影响.方法:将未冻融过的20份甲状腺功能检查患者血清样本进行T13、TT4、TSH、FT3、FT4的检测,检测结果作为基准参考水平,将检测后的血清-25℃冻存,复融后再次进行TT3、TT4、TSH、FT3、FT4定量检测,重复进行,直至检测结果与基准参考水平相比较有统计学意义.结果:冻融1次的血清样本,除TSH外检测结果与基准水平均有显著性差异(P<0.05),反复冻融2次以上的血清样本榆测结果与基准水平均有显著性差异(P<0.05).结论:用于甲状腺功能检测的血清样本不宜冷冻储存,好采血当天进行检测,否则会影响检测结果的准确性.

血清标本前处理对HBV-DNA测定的影响

目的 探讨标本前处理在乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)中对检测结果的影响.方法 采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测乙型肝炎病人血清标本及第2、4、6、8次循环冻融后的HBV-DNA含量变化和各循环冻融提取核酸后置4℃冰箱24 h后检测其HBV-DNA含量变化.结果 112份血清标本中,65例冻融后HBV-DNA含量较未冻融标本轻度升高(P＞0.05),占58.04％.线性回归显示HBV-DNA含量在每次冻融后较基线水平升高约8.91％,血清标本冻融对不同水平的HBV-DNA拷贝数影响不显著;血清标本提取核酸后4℃冰箱静置24 h后上机检测,其HBV-DNA含量较直接上机法呈下降趋势(P＜0.05).结论 血清标本经过2～8次冻融后,其HBV-DNA水平基本稳定;血清HBV-DNA提取核酸后4℃冰箱长时间保存会导致DNA的降解.

深低温反复冻融杀伤人眼脉络膜黑色素瘤OCM-1细胞的机制

[目的]研究-70℃反复冻融体外杀伤人眼脉络膜黑色素瘤细胞系OCM-1的机制.[方法]OCM-1细胞反复冻融后,用噻唑蓝比色法及克隆形成实验检测细胞的杀伤情况和细胞生长活力,免疫组织化学方法检测细胞P16表达的变化,电镜及共聚焦显微镜观察冻融后细胞凋亡和坏死的形态学改变,并测定细胞的凋亡比率,流式细胞仪检测冻融前后细胞CD40表达比率及细胞膜电位的变化.[结果]噻唑蓝比色法检测及克隆形成实验显示,冻融可以直接杀伤OCM-1细胞,且残存的细胞生长能力也明显受抑制.免疫细胞化学染色见对照组的细胞呈P16阳性,而冻融后的细胞均呈阴性,冻融后培养的细胞部分呈阳性.电镜下观察到冰晶的结构特征及细胞的坏死和凋亡等变化.激光共聚焦显微镜观察发现凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多.流式细胞仪测定显示冻融后细胞膜电位下降,冻融前后CD40阳性细胞比率差异明显,且呈一定的量效关系.[结论]冻融不仅可以明显杀伤OCM-1瘤细胞,还能抑制残存瘤细胞生长.反复冻融能诱导大量的肿瘤细胞发生凋亡,此为杀伤肿瘤及诱导肿瘤退变的直接原因,其机制与线粒体膜电位及P16表达下调有关.冻融后瘤细胞坏死因子CD40表达增强,可能是增强机体的免疫应答,介导机体免疫杀伤瘤细胞的机理.

医院体外诊断试剂冷链管理初探

体外诊断试剂是比较特殊的医疗器械或药品,在疾病的预防、诊断、治疗监测、预后观察,健康状况评价以及遗传性疾病的预防中起重要的作用.我院临床检测中心,病理科,生殖医学中心及其他各实验室使用的需2～8 ℃冷藏保存或-18 ℃冷冻保存的各类试剂大概有870种之多,占总品种数的80%左右.对生物制品,除另有规定外,成品应在2～8 ℃避光贮存、运输,不得冷冻[1].冰冻保存的试剂不能反复冻融.反复冻融会使试剂中的因子失活而影响测定结果[2].温度是保证这些试剂质量的重要方面,从生产出来到使用前所有程序都要符合冷链要求.所谓冷链就是指冷藏冷冻类商品等温度敏感性商品从生产企业成品到使用前的整个存储流通过程都必须处于规定的温度环境下,以保证商品质量的特殊供应链系统.鉴于体外诊断试剂在医院诊疗中的重要性,体外诊断试剂的冷链管理在试剂管理中的重要性,笔者从医院管理的角度对此作初步的探讨.为了方便讨论,本文将需冷藏或冷冻存储的体外诊断试剂统称为冷链试剂.

OsLEA5蛋白对乳酸脱氢酶体外保护机制的研究

目的：确定胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA蛋白）在体外不同压力胁迫下对酶活性的保护作用，并对其可能机制进行探讨。方法评估OsLEA5蛋白对于防止乳酸脱氢酶（LDH）免受高温（43℃）、反复冻融和干燥脱水伤害的保护能力。磷酸盐缓冲液、牛血清蛋白（BSA）和纯水分别用于阳性和阴性对照。结果 OsLEA5蛋白组相对活性百分比在热处理10、20、30 min后分别是纯水对照组的2.2、3.7、5.4倍。在5个反复冻融循环后，纯水对照组的LDH活性降至7%甚至更低，而质量比2∶1和5∶1的OsLEA5蛋白组分别为28%和69%，质量比为10∶1组其活性几乎未受到影响。经过干燥处理后，不同质量比组LDH活性均有明显降低，其中纯水对照组和磷酸盐缓冲液组的LDH接近完全失活。质量比为5∶1和10∶1的OsLEA5蛋白组相对活性分别达24%和36%。结论 OsLEA5蛋白能够在各种环境胁迫下有效保护底物酶的体外活性或防止失活。

139.FFP反复冻融后维生素K依赖性凝血因子和纤维蛋白水平保持稳定