NK细胞的免疫学调节功能—"NKh1/NKh2假说”的提出

近年的研究发现NK细胞具有强大的细胞因子分泌功能,在机体免疫调节中发挥重要作用.我们通过RT-PCR技术检测了正常外周血NK细胞群体表达Th1/Th2两类细胞因子mRNA的特点,利用细胞因子IFN-γ及IL-4对NK细胞进行了促漂移研究,并在此基础上对NK细胞株YT细胞因子的表达及其克隆化进行检测.发现NK细胞在不同作用条件下可不同程度的表达Th1/Th2两类细胞因子,在此基础上我们提出NKh1/NKh2假说.

基因芯片与生物信息学

人类基因组计划的发展不但产生了一门新的科学--即生物信息学(Bioinformatics),同时也发展出一项新的技术--基因芯片(Gene Chip).这一门科学和技术在揭示生物奥秘的科学研究中已经显示出巨大的作用.

PH结构域与细胞信号转导

PH结构域是一段存在于血小板中的主要的PKC底物Pleckstrin中的重复序列.同源序列分析证实这一约100个氨基酸组成的相对保守的序列亦存在于多种其它的信号转导分子例如:蛋白激酶类,GTP酶类,GTP结合蛋白调节分子,磷酯酶C以及某些细胞骨架蛋白中.这样的分布特点表明PH结构域可能与SH2或SH3结构域的功能类似,即介导信号转导分子间的相互作用,构成细胞信息传递的网络.蛋白酪氨酸激酶Tec家族成员Btk的N端含有PH结构域,其点突变可导致遗传性免疫缺陷病(XLA)的现象提示该结构域在B细胞的发育中可能具有重要功能.

人源抗体研制及应用进展

单克隆抗体(mAb)技术问世已25年,但由于人mAb制备的困难和鼠mAb的异源性,使mAb在人体内治疗方面的应用进展缓慢.近来由于人源化mAb研制的进展及突破,治疗用抗体的开发呈现了强烈的上升势头,在生物高技术领域中成为一个热点.目前mAb市场正以20%速度递增,预计2002年达11亿美元,占重组药物的9%.10年后市场上的治疗性mAb将从现在的几个增加到100个以上,预计销售额超过500亿美元.我国人源治疗性抗体的研制开发尚处于起步阶段,应当有所加强.

HLDA7专题讨论会新增CD编号和抗原

第7届人类白细胞分化抗原专题讨论会(7th workshop and conference on human leukocyte differentiation antigen, HLDA7)于2000年6月在英国Harrogate召开.HLDA7增加了67个新的CD编号(CD167a～CD247,其中仍有暂时空缺编号),并对前六届确定的CD1～CD166中补充了16个新的CD抗原,因此,实际上本次大会新增加83个CD编号或抗原.

角质细胞、混合皮肤移植和免疫调节

1 皮肤相关淋巴细胞(SALT):皮肤免疫系统面临概念的更新1.1 SALT只包括真皮→真皮、表皮同时涉及;1.2 表皮中免疫细胞为郎罕细胞→同时包括郎罕细胞(Lhc)、角质细胞(Kc)和T细胞;1.3 皮肤免疫应答由Lhc捕获抗原至引流淋巴结激活T细胞→T细胞可以同时在表皮和真皮中被激活;1.4 角质细胞主要参与炎症反应发挥屏障作用→可直接参与T细胞激活.但同种异体移植中Kc对T如何发挥作用未明?分泌细胞因子、趋化T细胞因子?直接刺激?递呈抗原?免疫调节?

细胞工程技术在肿瘤免疫治疗药物中的现状和应用

细胞工程是生物工程的一个重要组成部分,近年取得了极大发展,已被广泛应用于医药、畜牧业和环境保护等许多领域,取得了较好的社会效益和经济效益.做为一门应用科学和工程技术,细胞工程形成的历史还很短,因此定义还不十分完善.

抗肝癌单链抗体(鼠及人源化)融合突变型TNF-α的构建、表达及其作用研究

我室从HAb25抗肝癌单克隆抗体中制备并高效表达了抗肝癌鼠及人源化单链抗体m/hscFv25(人源化工作由军事医学科学院袁清安等完成),与人天然型TNF-α连接后取得了一定的治疗效果.但由于天然型TNF-α的毒副作用很大,我们尝试用高活性、低毒性的突变型TNF-α(mTNF-α)将之替代,构建新型、高效、低毒的抗肝癌抗体原核表达载体pGEX4T-1/scFv25-mTNF-α,通过诱导表达、纯化后,对SMMC-7721肝癌细胞及荷肝癌裸鼠进行导向治疗研究.

基因工程抗体-从实验室构想到临床实践

随着基因工程和蛋白质工程等生物技术在抗体研制领域的广泛应用,基因工程抗体的种类日趋多样化,构建日趋合理化,在体内的生物学效应也日臻完善,使之较天然单克隆抗体的治疗效果更好,范围更广.大量动物实验和初步临床试验结果令人振奋.基因工程抗体正从实验室走向临床,为一些难治性疾病提供了新的有效的治疗手段.针对多种疾病的基因工程抗体纷纷进入了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验阶段,已有十几种抗体获得FDA批准.与传统的化学治疗相比,抗体治疗的缺点是价格昂贵和市场范围小,限制了其在商业上的发展.因此需要进一步的基础免疫学研究阐明抗体的作用机制;发展抗体制备技术降低抗体的生产成本;进行更广泛的临床试验来研究抗体及其复合物怎样应用才能理想地提高疗效、降低毒副作用.

兔足重度冻伤后红细胞免疫粘附功能的动态变化

目的通过测定红细胞膜C3b受体的活性和红细胞膜吸附的免疫复合物,揭示冻伤对红细胞免疫吸附的作用.方法对兔足重度冻伤后,采用红细胞膜C3b受体花环法和红细胞免疫复合物花环法进行检测,连续观察冻伤后红细胞受体功能的动态变化.结果冻伤早期红细胞膜C3b受体花环率比正常明显下降(P＜0.01),后逐渐恢复;红细胞免疫复合物花环率显著提高(P＜0.01),并且一直高于正常.结论重度冻伤后红细胞膜的免疫吸附功能下降,导致免疫复合物沉积于某些器官、组织中造成损害.

大鼠肝组织细胞核基质的激光共聚焦显微镜观察

目的观察大鼠肝组织细胞核基质的分布,并进行细胞核基质的三维重建.方法应用间接免疫荧光染色显示核基质的基本形态,在激光共聚焦显微镜下观察,并进行细胞核基质的三维重建.结果大鼠肝组织细胞核基质仍保持细胞核的形态,呈粗大的黄绿色点片状荧光,细胞核基质的三维重建图显示核基质出现在分裂晚期的肝细胞胞浆中.结论成功地显示了大鼠肝组织细胞核基质的图像,并进行了核基质的三维重建.

我国YN株恶性疟原虫红内期瞬时转染系统的初步建立

目的建立我国YN株恶性疟原虫(P.f)红内期瞬时转染系统.方法将含有不同长度片段GBP130启动子的质粒,采用电穿孔法转染入环状体P.f,以液体闪烁计数法检测各质粒中报告基因CAT的表达.结果各质粒中启动子的表达强度有差异,表明转染P.f获得成功.结论首次建立了我国YN株P.f的瞬时转染系统,为进一步研究P.f的基因表达调控和基因功能奠定了基础.

藻胆蛋白荧光免疫检测中包被条件的探讨

目的初步确定藻胆蛋白荧光免疫检测适用的包被缓冲液.方法结合普及型藻胆蛋白荧光标记诊断试剂盒的研制,比较不同pH值和不同离子强度的包被缓冲液对抗体包被效果的影响.结果 0.01M,pH8.0磷酸盐缓冲液作为包被液是较为适宜的包被条件.结论该包被条件有利于在包被环节保持抗体活性,提高抗体的固相包被容量.

MTT比色法与ELISA法测定rhEPO体外生物学活性比较

红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是人体内调控红系祖细胞的重要造血生长因子,它能刺激红系前体细胞的分化、增殖及成熟.重组人红细胞生成素(rhEPO)是运用基因工程方法,把人EPO基因转入CHO细胞内进行分泌表达,再经过纯化工艺获得的活性蛋白.rhEPO在治疗慢性肾性贫血及肾功能衰竭方面具有良好的疗效.rhEPO生物活性测定方法分体外法与体内法,现就两种体外测定rhEPO生物活性方法进行研究与比较.MTT比色法,运用四甲基偶氮唑盐(MTT)在活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶作用下可被还原成蓝紫色结晶-甲形成量与细胞增殖程度成正比,从而通过rhEPO依赖株UT-7形成的甲量来定量测定rhEPO活性.双抗夹心ELISA法,用抗体包被固相载体后加rhEP0标准品与样品,使相应抗原与固相抗体结合后加入酶标抗体,后再与该酶的底物反应生成有色物质,通过标准曲线精确测得rhEPO样品生物活性单位.

单纯疱疹病毒1型感染人胚神经细胞的研究

目的观察人胚脑皮层细胞受到HSV-1攻击后的连续病变过程及感染特征.方法采用人胚脑皮层细胞原代培养,接种100 TCID50 HSV-1后用光镜、免疫组化染色观察病变全过程.结果接种HSV-1后4d逐渐出现细胞肿胀、变园、呈气球样改变,出现核内包涵体.结论 HSV-1接种所致的人胚脑皮层细胞出现连续的细胞病变,更接近地反映了人体在自然状态下感染HSV-1后的神经细胞病变过程.

肾综合征出血热病毒蛋白与抗人红细胞单克隆抗体偶联的方法

近年来,澳大利亚学者使用抗人红细胞mAb F(ab＇)2片段与人免疫缺陷病毒(HⅣ)的合成多肽抗原的化学交联物,以患者本身红细胞作为指示物,建立了称为自身血凝试验的检测方法(Autologous erythrocyte agglutination, AGEN)用于检测人外周血抗HIV抗体,其敏感性和特异性类似于ELISA;且整个试验过程仅需2min,是一种简易的快速免疫测定技术[1,2].

检测肾综合征出血热病毒抗体的自身血凝试验的建立

目的建立一种快速检测肾综合征出血热(HFRS)患者血液中病毒抗体的自身血凝试验方法.方法采用木瓜酶消化法制备红细胞糖蛋白单克隆抗体(mcAb)的F(ab＇)2片段,用硫酸鱼精蛋白提取HFRS病毒抗原,并用戊二醛法将两种蛋白偶联并制成双价试剂,以HFRS患者阳性血清与人"0”型血红细胞制成模拟全血标本,进行红细胞凝集试验.结果抗红细胞mcAb F(ab＇)2片段与HFRS病毒抗原蛋白发生有效偶联,可使HFRS的模拟本出现明显血凝,整个实验过程仅需30min.结论用自身血凝试验检测HFRS病毒抗体快速,简便,不需特殊设备,非常适合基层医疗单位应用.

子宫内膜异位症患者腹腔液对子宫内膜细胞MHC-Ⅰ类分子表达以及NK细胞功能的调节

目的分析子宫内膜异位症(EM)患者腹腔液对IFN-y诱导异位子宫内膜细胞上MHC-Ⅰ类抗原表达以及对正常人γδT细胞和自然杀伤细胞(NK)功能的影响.方法采用免疫荧光细胞检测及细胞毒活性检测法.结果 EM患者腹腔液对IFN-y诱导异位子宫内膜细胞上MHC-Ⅰ类抗原表达具有下调作用.疾病组的腹腔液对正常人外周血γδT细胞及NK细胞的杀伤功能具有负相调节作用.结论子宫内膜异位症患者腹腔液中存在yδT细胞及自然杀伤细胞功能的抑制因子,对IFN-γ诱导异位子宫内膜细胞上MHC-Ⅰ类抗原表达具有下调作用.

肝硬化患者体液中一氧化氮的检测意义

肝硬化患者易并发原发性腹膜炎及肾功能损伤,早期发现并积极防治是治疗成功的关键.但目前尚缺乏原发性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis SBP)、肾功能损伤早期的有效监测手段.一氧化氮(nitric oxide,NO)对腹膜感染、肾功能有着重要影响.我们通过对56例肝炎后肝硬化病人的血、腹水、尿中NO浓度的检测,了解其与并发症之间的关系,旨在阐明NO在原发性腹膜炎、肾功能损伤中的作用及意义.

原发性肺癌患者血清sIL-2R和TNF-α检测的临床意义

机体免疫功能低下或免疫调节功能紊乱是肿瘤发生、发展的重要因素.近年许多研究表明,恶性肿瘤患者细胞因子的产生及其受体表达异常,且与肿瘤的发生发展、疗效及患者的预后有一定的关系[1,2].IL-2和TNF-α是细胞因子网络中的重要组成部分,具有多种生物学活性,在抗病毒、抗肿瘤免疫及免疫调节中发挥着重要的作用[2-5].我们观察了73例原发性肺癌患者血清可溶性IL-2受体(sIL-2R)和TNF-α水平的变化,并探讨了其与肿瘤的临床分期及治疗之间的关系.

妇科盆腔疾病患者血清CA125的价值

CA125是一种高分子质量的糖蛋白,存在于卵巢肿瘤的腺腔上皮细胞内,其分子量为20 000-100 000[1],我们以标记吖啶酯的M11 mAb作为一抗,包被在磁粉颗粒上的0V125 mAb为二抗的化学发光免疫分析检测血清中CA125.探讨其在妇科盆腔疾病中的诊断意义.

胃癌细胞总RNA修饰树突状细胞的肿瘤疫苗效果

目的应用肿瘤细胞RNA修饰小鼠树突状细胞(dendrtic cell,DC)的肿瘤疫苗免疫小鼠,研究其抗肿瘤免疫作用.方法 CD11c磁珠抗体标记小鼠脾单个核细胞悬液,磁性细胞分选器(MACS)分选出CD11c+的DC,短期培养,以肿瘤细胞总RNA脉冲DC,以此瘤苗皮下注射免疫615小鼠两次,间隔1周,后1次免疫后7 d,实验鼠皮下接种5×105小鼠前胃癌细胞(MFC).结果经免疫后的小鼠具有较强抗肿瘤免疫,RNA脉冲DC的瘤苗免疫后肿瘤生长受到明显抑制,其外周血和脾细胞中NK活性均明显升高,肿瘤特异性CTL也明显升高.结论以肿瘤RNA作为抗原脉冲DC可诱导较强的抗肿瘤免疫.

用PCR技术检测鄂温克族3种基因的多态性

克族仅有近20 000人,主要聚居于我国东北地区,少数居住于黑龙江省.近几年随着分子生物学的快速发展,对人类健康群体的研究不断深入.国内外有报道关于不同人种、不同区域、不同民族的多种基因位点多态性分布,但关于鄂温克族却未见报道.我们采用PCR-RFLP和PCR-SSP法研究了鄂温克族3个基因位点:红细胞CR1(CD35)基因、血管紧张素转换酶(ACE)基因和HLA-DQA1基因的多态性分布,并与汉族、蒙古族做了比较分析.

人整合素分子β7亚基片段的表达鉴定及多抗制备

目的在大肠杆菌中高效表达人整合素分子β7片段并制备多抗.方法 DNA重组法构建表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中获高效表达.表达产物经免疫印迹鉴定后,用8mol/L尿素溶解包涵体,经SDS-PAGE纯化,免疫家兔获得多抗.结果β7片段在大肠杆菌中高效表达,表达产物以包涵体形式存在,免疫印迹鉴定为目的蛋白.多抗效价达1:102400.结论制备了抗β7的多抗,对β7整合素的功能研究有重要意义.

生晒参与红参体外免疫增强的作用

目的为了了解生晒参与红参体外细胞免疫功能的调节作用.方法采用3H-TdR掺入法检测两种参对PBMC体外增殖反应和ELISA方法对诱导细胞因子水平的测定.结果生晒参和红参能明显促进PBMC的体外增殖,两组相比P＜0.01,有高度显著性差异,并诱导高效价的细胞因子,特别是生晒参对PBMC的增殖反应及诱生PBMC高分泌IFN-γ尤为突出.结论生晒参与红参都为免疫增强剂,但免疫调节作用不完全相同.

大豆不同亚型钙调素抗原表位的分析

目的探讨制备抗不同亚型大豆钙调素单克隆抗体的可能性.方法借助于微机,对5种大豆不同亚型CaM分子的抗原表位进行预测和分析.结果大豆CaM分子存在6个抗原表位,其中至少有1个表位(氨基酸序列74～86)可刺激小鼠产生抗大豆不同亚型CaM分子的单克隆抗体(mAb).另外,在序列6,7,96及122,123附近也有可能是研制小鼠mAb的大豆不同亚型CaM分子抗原表位所在.结论为研制抗大豆不同亚型CaM分子上不同表位的mAb提供了实验依据,对研制其他植物钙调素单克隆抗体也有一定的参考价值.

人类Ⅱ型胶原蛋白活性肽段多聚基因的构建和表达

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的发展机理尚未完全阐明,目前认为与自身免疫密切相关,Ⅱ型胶愿蛋白(type Ⅱ collagen,CⅡ)是可能的自身抗原(1).国外的研究提示,CⅡ的这种免疫活性主要一现在其250-270片段(hCⅡ250-270)上[1,2].本文用基因工程的方法,选用大肠杆菌(E.coli)偏爱密码子,化学合成优化该片段的基因组成,利用酶切位点将其串联成六聚体,并在E.coli中进行表达,获得大量重组hCⅡ250-270的类似物,为进一步研究该段活性肽的功能提供条件.

结核杆菌低分子多肽抗原诱导活化的γδ+T细胞的细胞毒活性研究

目的探讨选择性扩增人γδ+T细胞的方法及其细胞毒活性.方法用耐热性结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb)刺激正常人PBMC,并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδ+T细胞,通过MTT试验观察γδ+T细胞对人红白细胞白血病细胞株K562的细胞毒活性.结果 Mtb刺激及磁珠分选后的γδ+T细胞可达73%和98%,效靶细胞比例为10:1时其对K562细胞的杀伤率分别为59%和78.5%.结论 Mtb刺激及磁珠分选所获得的高纯度γδ+T细胞可介导对K562细胞的高效细胞毒活性.

bcr/abl及c-myb原癌基因反义寡核苷酸对K562细胞的作用研究

目的为反义基因治疗慢粒白血病(CML)奠定实验基础,并进一步提示CML的发病机制.方法设计并合成针对bcr/abl嵌合基因和c-myb原癌基因的反义寡脱氧核苷酸(asODN)及其硫代衍生物.观察其对K562细胞的生长、DNA合成及bcr/abl基因转录、表达以及细胞凋亡的影响.结果针对bcr/abl基因及c-myb癌基因的asODN可显著抑制K562细胞的生长、DNA合成及bcr/abl基因转录、表达,并使K562细胞发生凋亡,其中硫代asODN的作用效果更好,两种asODN联合用药几乎可完全抑制bcr/abl基因的转录.结论①bcr/abl在CML发病中既能促使细胞增殖也能抑制细胞的凋亡;②联合应用针对几种与CML发病有关的癌基因的asODN,对反义基因治疗CML具有一定的实际意义.

痢疾菌毒力表型与抗原表达的关系

目的分析研究本室保存或构建的各类痢疾菌毒株、减毒突变株、菌苗株的毒力及其生物表型的相互关系,探讨与致病有关的成分,为改进现有菌苗和构建新型菌苗提供参考依据.方法采用刚果红结合试验、接触性溶血试验、HeLa细胞入侵试验及豚鼠角结合膜炎试验,对不同痢疾菌的毒力表型进行检测,并对大质粒及其侵袭相关的基因(4.1kb)进行遗传背景分析.用BA-immunoblot法,对痢疾菌和侵袭性大肠杆菌等进行毒力相关抗原的分析.结果有侵袭毒力的痢疾菌株均与刚果红染料结合、有接触性溶血活性,可侵入HeLa细胞,豚鼠角结合膜炎试验阳性,并都含有大质粒(120～140MD),与4.1kb侵袭探针杂交也均呈阳性反应;而无毒力的痢疾菌株上述生物表型均为阴性.有毒痢疾菌和侵袭性大肠菌均表达4种主要毒力相关抗原Ipa(A,B,C,D),而无毒株不表达这些抗原.痢疾菌的毒力不仅与Ipa有关,而且还与LPS抗原有关.结论细菌的毒力与生物表型密切相关.并且Ipa与LPS这两类抗原均表达时细菌才有毒力.

复方猪苓多糖对小鼠免疫功能的调节

目的比较猪苓多糖单、方剂对机体的免疫调节作用,验证中药制剂增强机体免疫功能和拮抗肿瘤的正向调节作用.方法本实验旨在观察猪苓多糖单、方剂对环磷酰胺免疫抑制效应的调节作用,通过检测小鼠淋巴细胞转化功能、NK细胞杀伤活性、T细胞亚群和IgG水平等指标来比较.结果复方猪苓多糖具有:①提高免疫功能低下小鼠T,B淋巴细胞转化能力;②增强免疫功能低下小鼠NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力;③上调免疫功能低下小鼠CD4+T细胞量,且对免疫功能低下小鼠的IgG产生具有一定的正向调节作用.结论复方猪苓多糖是一种正向免疫调节剂.

电磁脉冲对犬淋巴细胞损伤及其机制的实验研究

目的研究电磁脉冲(EMP)对犬淋巴细胞的损伤效应及其机制.方法用细胞化学、原位末端标记和免疫细胞化学技术,分析T淋巴细胞亚群、淋巴细胞凋亡以及Bcl-2和Bax蛋白的改变.结果 (1)2～12万V/m的场强能使外周血T细胞及其亚群出现不同程度的下降,其中以6万V/m照射后24 h为明显,T细胞及tH,Ts细胞数分别降低至对照值的77%,81%和63%;(2)在上述场强范围内,凋亡淋巴细胞随照射剂量的增加而明显升高.2,6和12万V/m照射后10 d,凋亡指数分别升高至对照值的1.32,2.75和5.11倍;(3)照射后淋巴细胞Bax蛋白的表达明显增强,而Bcl-2显著降低,与凋亡指数和照射剂量呈相关关系.结论首次证实一定场强的EMP确实能损伤淋巴细胞,并呈现出较好剂量效应关系;淋巴细胞凋亡是EMP损伤淋巴细胞和机体免疫功能降低的主要原因;Bax和Bcl-2在上述凋亡调控中起重要的作用.

重组卡介苗对小鼠巨噬细胞活性及细胞因子产生的影响

目的将rBCG-IL-2应用于动物实验,观察其对肿瘤生长和免疫功能的影响.方法采用基因工程技术构建rBCG-IL-2,用黑色素瘤细胞株B16接种于小鼠小腿外侧皮下,再用rBCG-IL-2局部治疗,2 wk处死小鼠,用MTT法检测腹腔巨噬细胞活性,ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IL-2,IFN-r和GM-CSF的含量.结果 rBCG-IL-2对肿瘤生长的抑制作用与对照组比较有显著性差异P＜0.01.rBCG-IL-2还能诱导机体IL-2和IFN-r产生和增强巨噬细胞的杀瘤活性.结论 rBCG-IL-2能通过诱导机体细胞因子的产生和提高巨噬细胞的杀瘤活性,抑制肿瘤生长,甚至清除肿瘤细胞.

rhIL-1ra减轻新生大鼠窒息后肾损伤的作用机制

目的探讨重组的人白细胞介素1-受体拮抗剂(rhIL-1ra)减轻新生大鼠窒息后肾损伤的作用及机制.方法Witsar大鼠30只,7～10 d龄,随机均分为窒息组、窒息+rhIL-1ra处理组和对照组.在窒息30 min复氧120 min时,测定左肾系数(LRC);用硫代巴比妥酸法测定肾组织过氧化脂质(LPO)含量,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-8(IL-8)的水平.对肾小管损伤程度进行评分,计数肾微血管床的白细胞滞留数.结果窒息组白细胞滞留数、左肾系数、肾小管损伤评分及组织中LPO,TNF-α和IL-8的含量均较对照组升高,差异显著(P＜0.05).白细胞数与左肾系数、肾小管损伤评分、LPO,TNF-α和IL-8含量之间呈显著的正相关(r值分别为0.49,0.55,0.51,0.48,0.70,P均＜0.05).窒息+rhIL-1ra组上述指标均显著下降,且与正常组差异不显著(P＞0.05).结论 rhIL-1ra可能是通过减少窒息后肾组织炎性细胞因子的产生和白细胞滞留等途径而保护窒息后肾损伤.

汉滩病毒感染成龄鼠模型用于特异性单克隆抗体保护作用的研究

目的建立汉滩病毒感染成龄鼠的模型,以进行mAb的保护实验.方法将7～8 wk Balb/c小鼠于感染病毒前1 d及感染后1 d,2 d和4 d,分别经腹腔注射环磷酰胺65 mg/kg体重,总剂量为260 mg/kg体重,观察其发病及死亡情况,并检测其体内不同脏器中汉滩病毒抗原的分布及滴度.用mAb对上述感染小鼠进行保护实验.结果经环磷酰胺处理的成龄鼠,由汉滩病毒隐性感染变为急性致死性感染(死亡率达100%).其发病症状与汉滩病毒感染的乳鼠类似,平均发病与死亡时间较感染乳鼠晚2～3d,且较为规律和集中.汉滩病毒抗原在感染的成龄鼠和乳鼠体内的分布及滴度基本相同.用mAb对感染的成龄鼠和乳鼠分别进行保护实验,结果完全一致.结论经环磷酰胺处理的成龄鼠,可作为汉滩病毒和HFRS研究用的动物模型.

链球菌蛋白G快速纯化人源生物工程抗体

目的根据链球菌蛋白G与人抗体的Fab片段有弱结合位点的特征,探索应用蛋白G亲合纯化原核表达的人源mAb片段的可行性,为人源基因工程抗体的批量制备提供依据.方法扩增抗HBs+菌株,经IPTG诱导表达后制备表达产物上清,与商品化链球菌蛋白G亲合胶(GammaBind)反应,PBS洗去非特异结合蛋白,梯度酸洗脱结合UV检测观察解离效果,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检验纯化产物的纯度,Dot Blot鉴定亲合纯化后Fab的抗原反应性,并与抗Fab抗体亲合纯化法进行比较.结果在酸洗脱的早期(pH4.5)即有特异蛋白解离,峰值在pH3.54.0之间,纯化后的抗体片段在PAGE中形成单一区带,达到电泳纯;酶标抗Fab抗体免疫印迹结果证明,电泳显示的单一区带确为Fab蛋白区带;抗原特异Dot blot检测表明,该法制备出的Fab保持了抗原结合活性,且在得率和活性方面优于抗-Fab抗体法.结论本实验采用的一步亲合纯化法具有操作简便、纯化快速和高效的特点,是人源性mAb Fab片段纯化的较佳方法.

HIV-1gp120基因及其与IFN-α基因共表达产物的构建和实验研究

目的研究细胞因子IFN-α在机体免疫应答过程中的免疫佐剂效应.方法以表达中国流行株HIV-1gp120基因的核酸疫苗质粒pGP及共表达中国流行株HIV-1gp120基因与IFN-α基因的核酸疫苗质粒pGPIFN-α免疫Balb/c鼠,用流式细胞仪测定10 000个免疫鼠脾淋巴细胞中CD4+,CD8+T细胞数及CD4+/CD8+比值.结果 pG-PIFN-α与pGP比较,pGPIFN-α免疫鼠CD4+和CD8+T细胞数明显提高.结论在机体的免疫应答过程中,细胞因子IFN-α能很好地发挥免疫佐剂的作用.

R-藻红蛋白荧光标记单克隆抗体的研制

目的研究国产R-藻红蛋白标记二抗的工艺,对异双功能试剂的用量进行比较实验.方法不同稀释度的异双功能试剂SMCC处理R-PE使之衍生化,SPDP与二抗反应使之衍生化再经DTT处理从而给二抗引入外源巯基.将二者混合反应完成交联.结果 SMCC与R-PE的摩尔比为56:1时,交联物的R-PE与抗体结合比接近1:1,R-PE与抗体的利用率高.结论以本文所述工艺进行藻红蛋白的荧光标记,交联物荧光强度较高、交联抗体活性损伤很小.

人TRAIL在毕氏酵母表达系统中的表达

目的在甲醇营养型酵母(Pichia)中,表达人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)分子.方法将可溶性TRAIL基因片段插入酵母表达载体pIC 3.5,经氯化锂转化酵母GS115,甲醇诱导表达,5 d后用SDS-PAGE和Western-blot进行分析,并用L929细胞测定其活性.结果在酵母细胞中表达的TRAIL,SDS-PAGE分析占总蛋白的50%以上.用抗人TRAIL多抗检测表明,表达的TRAIL分子,杀伤肿瘤细胞的比活性较原核表达后复性的TRAIL明显提高,并能诱导几株肿瘤细胞DNA片段化,说明TRAIL可能已正确折叠并形成活性必须的高级结构.结论在Pichia系统中成功地表达人可溶性TRAIL分子,为研究其作用机制创造了条件.

3-磷酸甘油醛脱氢酶的提取及其单克隆抗体的制备

抗人Lp(a)单链抗体基因的构建及序列测定

目的构建鼠抗人脂蛋白(Lp)(a)单链抗体(ScFv)基因.方法在从分泌高亲和力的抗人Lp(a)单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取细胞的总RNA,以随机引物反转录合成cDNA,以特异引物进行PCR,扩增单抗的VH和VL基因.采用限制性内切酶酶切拼接法,并按VH-Linker-VL的结构,将VL和VH基因拼接成单链抗体基因,并进行序列分析.结果拼接成的ScFv基因长度约为730 bp.结论所构建的为功能性抗Lp(a)ScFv基因.

抗人红细胞血型A抗原双价小分子抗体基因的构建和表达

目的分离抗人红细胞血型A抗原单抗50A可变区基因,构建并表达其双价小分子抗体(diabody)融合蛋白.方法设计合成抗体重轻链可变区引物,通过加端PCR技术,在50A Va和VL基因两端引入连结短肽和适当的限制性酶切位点,体外构建50A diabody基因并将其克隆入pGEX-4T-2表达载体中,在大肠杆菌中诱导高效表达.用双脱氧核苷酸链末端终止法分析其核苷酸序列.结果序列分析表明,50A diabody基因全长为717bp;其中VH长366bp,编码122个氨基酸;VL长336bp,编码112个氨基酸,两者以五肽连接头相连.重组体表达产物SDS-PAGE电泳显示,其相对分子质量(Mr)为51 000左右,与预期的结果相符;光吸收(A)扫描结果表明,GST-50A diabody融合蛋白占菌体总蛋白的22.5%,产物主要以不溶性的包涵体形式存在.结论成功构建表达了50A双价小分子抗体基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为研制基因工程血型检定抗体奠定了基础.

人MBL相关丝氨酸蛋白酶-1 cDNA的克隆与鉴定

目的获得人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶-1(MASP-1)基因.方法以人胎肝组织总RNA为模板,采用RT-PCR获取目的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体,进行酶切图谱分析和测序鉴定.结果以RT-PCR方法获得了含信号顺序的全长MASP-1 cDNA,将其与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌TG1,建立了MASP-1的cDNA克隆.酶切图谱与微机分析结果一致.序列分析表明,与GenBank中的人MASP-1 cDNA比较,仅1个位置的核苷酸不同,其编码产物是19个氨基酸残基的信号顺序和680个氨基酸残基的MASP-1蛋白.结论成功克隆了人MASP-1的cDNA,为深入研究补体凝集素途径的激活机制和MBL基因突变所致免疫缺损的机制奠定了基础.

人肿瘤坏死因子α单链抗体的原核表达和活性分析

目的在大肠杆菌中表达抗人TNF-α单链抗体(ScFv),并分析它的结合活性和中和活性.方法在获得抗人TNF-α E6ScFv基因的基础上,用热诱导载体pBV220在大肠杆菌中表达E6ScFv蛋白.ELISA测定抗体的结合活性,实时BIA技术确定亲和常数,L929细胞毒试验分析其中和活性.结果克隆了抗人TNF-α E6SeFv基因的热诱导载体pBV220在大肠杆菌中,经42℃热诱导,得到了相对分子质量(Mr)约为27 000的重组蛋白质,表达量占菌体总蛋白的18%.对在大肠杆菌中表达的E6ScFv进行了复性和亲和层析纯化,并进一步证实:①E6ScFv具有与hT-NF-α结合的活性,其结合表位与亲本抗E6单克隆抗体(mAb)相同;②E6ScFv与hTNF-α的亲和常数为3.71×104M-1;③E6ScFv具有中和hTNF-α细胞毒作用的活性.结论以上结果有助于ScFv拮抗TNF-α的治疗.

胶质瘤单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的构建并高效表达抗胶质瘤单链抗体(ScFv),为基因工程双功能抗体的制备及进一步用于脑肿瘤的诊治奠定基础.方法以重、轻链可变区基因构建ScFv基因,并克隆入表达载体pGEX-5X-1,在大肠杆菌BL21 DE3中诱导表达,以SDS-PAGE及Western blot检测表达产物.结果以限制性内切酶酶切及DNA测序证实,基因构建正确,表达产物的相对分子质量(Mr)为52 000,与理论值相符,表达量占菌体总蛋白的42%.结论实现了胶质瘤ScFv的高效表达,为胶质瘤的导向诊治提供了新的治疗选择.

第四次全国医学分子微生物学和免疫学学术会议征文通知

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