小鼠白介素-12基因转染对EL细胞在小鼠体内成瘤性的抑制作用

目的探讨逆转录病毒(RV)载体介导的小鼠白介素12(mIL-12)融合基因转染,对低免疫原性的小鼠T细胞淋巴瘤细胞EL4体内生长的影响.方法用共培养法导入基因,以PCR法检测基因的导入.以脾细胞增殖法测定mIL-12的生物学活性.观察导入mIL-12基因的肿瘤细胞EL4/12于小鼠皮下接种后的成瘤性.对预先接种野生型肿瘤细胞EL4的小鼠,用60Co照射的肿瘤疫苗EL4/12接种于瘤周,观察瘤苗的抗肿瘤作用等.结果在EL4/12细胞中,用PCR可特异地检测到mIL-12 p35和P40亚基的cDNA片段.5×105 EL4/12细胞48 h表达的mIL-12达(10.2±3.2)ng.EL4/12细胞在小鼠体内的成瘤性明显下降.EL4/12瘤苗治疗组约50%的小鼠可长期无瘤生存,而对照组小鼠则在短期内全部成瘤死亡.部分长期生存的小鼠产生了有效的抗肿瘤免疫,能耐受野生型肿瘤细胞的二次攻击.与对照组相比较,疫苗治疗组中其余小鼠的成瘤时间延迟(P＜0.01),小鼠存活时间延长(P＜0.01);死亡时肿瘤体积小(P＜0.05),形成的肿瘤有完整包膜,瘤周和肿瘤内部有较多的淋巴细胞和浆细胞浸润等.结论转染mIL-12基因能抑制EL4肿瘤细胞的成瘤性.mIL-12基因修饰的肿瘤疫苗对野生型肿瘤细胞具有治疗作用.

hsTR55/TR75-preS1融合蛋白的表达与应用

目的简化测定hTNFα及其突变体的受体竞争结合活性的方法.方法将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)前S区(preS1)肽段(2～50)编码区,分别融合于hsTR55和hsTR75基因的C末端组成融合受体分子基因,并利用细小RNA病毒属脑炎心肌炎病毒EMCV的内核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES),构建了hsTR55/hsTR75以及它们与preS1组成的融合受体分子hsTR55/hsTR75-preS1基因和新霉素抗性(neoR)基因的双顺反子表达载体,转染BHK-21细胞后用G-418持续筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株.结果 RT-PCR及ELISA均证实,两种融合受体分子表达,并且表达上清对hTNFα的活性均具有一定的中和作用.在对表达上清进行ELISA定量后,我们还用Biosensor方法测定了这些可溶性受体分子与hTNFα的结合常数.结果表明,在融合preS1肽段前后,hTNFα与受体分子的解离常数变化不大.结论利用表达的两种融合受体分子,成功地建立了一种检测hTNFα及其突变体的受体竞争结合活性的ELISA法,并利用该法测定了野生型hTNFα及其4种突变体的受体竞争结合活性,所获结果与利用125I-hTNFα测定的结果具有相当的可比性.

稳定高效表达TNF-α基因及其突变体的H22肿瘤细胞株的建立

目的建立转染3种TNF-α基因(分泌型TNF-α突变体、跨膜型TNF-α突变体和野生型TNF-α的H22细胞株,以比较不同类型TNF-α的杀瘤效应.方法采用逆转录病毒载体,将3种TNF-α基因导入小鼠H22肿瘤细胞中,用Southern印迹、RT-PCR、流式细胞术和生物学活性检测等方法,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性4个方面,对转染细胞进行检测鉴定.结果 3种TNF-α基因均在H22细胞中得到有效表达,并具有生物学活性.结论获得3种稳定高效表达TNF-α的H22肿瘤细胞株,为进一步研究跨膜型和分泌型TNF-α体内的抑瘤效应建立了良好的实验模型.

可溶性CD14突变体的构建与表达研究

目的将人CD14信号转导启动区97～101氨基酸进行丙氨酸置换突变,构建真核表达质粒,并在COS-7细胞中进行表达.方法采用两轮聚合酶链反应定点突变方法,对人可溶性CD14推测中的LPS信号转导启动区之一,N端97～101氨基酸用丙氨酸进行置换突变.将突变PCR片段克隆至载体pGEM-T,进行酶切鉴定及序列分析.将突变基因亚克隆至真核表达质粒pCIneo中,转染C0S-7细胞进行瞬时表达,并用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白.结果测序结果证实,CD14的N端97～101氨基酸发生了连续丙氨酸置换突变.SDS-PAGE表明,突变体基因在COS-7细胞中得到瞬时表达.Western blot显示,抗CD14多克隆抗体可与重组表达的突变体蛋白特异性结合.结论成功地构建并表达CD14 97～101氨基酸丙氨酸置换突变体,为研究CD14信号转导缺失突变体的生物学活性与功能打下了基础.

Caspase-3对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的探讨由野生型人caspase-3大小亚基颠倒构建的重组型caspase-3的促细胞凋亡活性.方法用RT-PCR法获得人caspase-3基因.通过重组PCR进行改造,构建小亚基位于大亚基之前的两种重组型caspase-3基因,它们所对应的蛋白质的N端,分别带有或没有其自身识别的四肽序列.将上述基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pIRES2-EGFP中,转染人HeLa细胞,在荧光显微镜和电镜下观察转染细胞的形态和结构.结果成功地获得了野生型caspase-3基因及两种重组型caspase-3基因.构建了重组型caspase-3基因的表达载体.转染HeLa细胞后,重组型caspase-3基因在细胞中得到表达,随后引起细胞荧光强度下降,生长状况变差甚至死亡.电镜观察显示,许多细胞呈现凋亡的典型特征.结论重组型caspase-3可促进HeLa细胞的凋亡.

高效原核融合表达载体(pBVIL1)的构建及在HCV抗原表达中的应用

在对作为试剂抗原的研究中,为尽量减少抗原中无关片段可能引起的非特异性反应,常需采用以特异性抗原表位为主的小分子肽.但有时为了增加抗原的覆盖面以提高检测的灵敏度,又需用含有多个抗原表位的融合抗原[1,2].用人工合成肽成本较高,且肽与肽间的化学连接难以达到定向和得到稳定的产物.若能进行小分子肽基因的重组表达,并进而将其相互连接融合表达为理想.为实现上述目的,我们构建了表达载体pBVIL1.此载体是我们在以前克隆的表达质粒[3]pBV220/HL-1β的基础上而构建的.即在相当原质粒中的IL-1β基因中,插入两个酶切位点,使插入的基因片段与IL-1β基因融合获得高效表达.同时,通过对引入的酶切位点选择和设计通用引物,也可实现基因间的连接和融合表达.

HBV与HCV融合DNA疫苗的构建及其体液免疫应答

目的构建含乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因(S区基因)与丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原基因(C区基因)的嵌合真核表达载体,观察preS1和preS2基因对HBV表面抗原及HCV核心抗原体液免疫的影响.方法用PCR方法,分别扩增HBV S区基因和HCV C区基因.将S区基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,酶切鉴定后,再将C区基因克隆至S区基因的下游.测序正确后,大量提取质粒并免疫Balb/c小鼠,用ELISA法检测抗HBs和抗HCV抗体.结果成功地扩增出目的基因片段,克隆后酶切鉴定结果正确,序列分析与文献报道相一致.免疫后检测到抗HBs和抗HCV抗体.preS1与preS2基因对构建的融合DNA疫苗的体液免疫应答有一定的抑制作用.抗HBs抗体的产生低于只含S基因的真核表达载体;preS1基因对抗HCV抗体的产生具有抑制作用,而preS2无影响.结论不同长度的HBVS区基因可影响抗HBs和抗HCV抗体的产生.

幽门螺杆菌vac A基因毒性相关片段原核表达载体的构建和表达

目的构建幽门螺杆菌(Hp)Vac A基因片段原核表达载体并进行表达.方法采用PCR技术,扩增Hp vac A基因的1个片段B,并克隆入pGEM-3Zf(-)质粒.测序正确后,再克隆入质粒pRSETA中,构建重组表达载体pILSE-TA-B.结果经过转化层 E.coil BL21 DE3(plysS)后,诱导表达出相对分子质量(Mr)为33 000的蛋白.SDS-PAGE分析显示,表达量占全菌总蛋白质的47.8%,上清中目的蛋白占全菌总蛋白的10.9%.ELISA和Western blot分析表明,表达蛋白能与兔抗Vac A多抗结合.结论成功地构建原核表达载体pRSETA-B,为进一步探讨该片段的生物学活性,以及临床上通过检测患者血清预测Hp的感染提供了实验依据.

支架置入兔颈动脉后平滑肌细胞增殖及c-myc基因的表达

目的观察兔颈动脉内支架置入后,血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖及c-myc原癌基因的表达.方法将国产铂-铱合金支架置入16只家兔颈动脉,术后7、14、30和90 d处死动物,行苏木素伊红(HE)和Masson三色染色、c-myc蛋白免疫组化染色及原位杂交.用透射电镜观察术后14 d,VSMC超微结构的变化.结果术后7 d,中膜VSMC由收缩型变为合成型,内弹力板消失,偶见炎性细胞浸润,1例血管腔内出现不完全血栓形成.术后14 d,新生内膜增生明显,主要由合成型及过渡型VSMC组成.术后30 d,新生内膜增生更加明显,主要为收缩型和少量过渡型VSMC及细胞外基质组成.术后90 d,内弹力板恢复为弯曲的连续状,其上附着多层内皮细胞,VSMC为收缩型.术后14 d透射电镜显示,合成型VSMC呈圆形或椭圆形,粗面内质网及线粒体非常丰富.支架置入后,兔颈动脉新生内膜中c-myc蛋白免疫组化及原位杂交均呈阳性,正常对照血管呈阴性.结论兔颈动脉内置入支架后,可引起VSMC中c-myc基因表达增强,其与VSMC的增殖密切相关,在支架内再狭窄的形成中发挥重要作用.

一种新的人活化T细胞抗原p140的分布及其功能的研究

目的观察一种新的活化T细胞膜分子p140的分布、相对分子质量(Mr)和功能.方法用免疫荧光染色和流式细胞术观察p140分子的分布;采用重导向杀伤实验观察其对杀伤功能的调节;应用生物素标记细胞膜分子、免疫沉淀及化学发光测定p140的Mr.结果 p140分子可选择性地表达于混合淋巴细胞培养(MLC)所产生的活化T细胞表面,而在抗CD3 mAb、PHA、PMA或PMA+A23187几种刺激剂活化的人外周血单个核细胞(PBMC)上未见表达.p140还分布于一些人急性T细胞性白血病细胞系.在重导向杀伤实验中,p140与CD3分子有协同作用.p140 Mr为140 000.结论 p140可能为一种新的移植抗原诱导的T细胞活化分子,同CD3分子具有协同刺激作用.

人CD81胞外区EC2基因的克隆和原核表达

CD81是一种跨膜的非糖基化蛋白.在人类和黑猩猩中,CD81胞外区EC2区氨基酸序列高度保守.CD81可影响细胞的粘附、激活、增殖和分化,改变细胞形态及抑制合胞体形成等生物学功能[1].近年研究发现,CD81可能作为HCV的受体引导病毒进入细胞内[2].进一步研究发现,CD81胞外区EC2是CD81与HCV E2相互作用的部位,是HCV感染的关健因素[3].目前,CD81的功能及作用机制尚有待进一步研究,我们采用分子生物学技术,构建了CD81胞外区EC2原核表达载体,为今后进一步研究CD81与HCV感染的关系奠定了基础.

HBV阳性血清诱导人外周血单个核细胞凋亡的检测及意义

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)对外周血单个核淋细胞(PBMC)凋亡的作用.方法利用10名健康献血员外周血分离PBMC,分为加HBV阳性血清组和加健康人血清对照组,经培养72 h后,采用PI染色法在流式细胞仪上检测细胞的凋亡情况.结果加HBV阳性血清组培养细胞的凋亡率为(39.56±7.03)%,明显高于加健康人血清组培养细胞的凋亡率(27.57±7.78)%,两组间具有非常显著的差异(P＜0.02).结论 HBV可能具有诱导PBMC凋亡的能力,这可能是形成HBV慢性感染免疫耐受的一个重要机制.

患者外周血中T、B细胞表面Fas和bcl-2表达的研究

目的探讨活动期SLE患者外周血中T、B细胞表面Fas和bcl-2的表达水平及其与T、B细胞凋亡的关系.方法采用流式细胞术,测定活动期SLE患者外周血T、B细胞表面Fas和bcl-2的表达,并同时测定患者血中T、B细胞的凋亡.结果①活动期SLE患者外周血中B细胞及CD8+T细胞表面bcl-2的表达明显高于正常人(分别为P＜0.05和P＜0.01);CD4+及CD8+T细胞表面Fas的表达高于正常人(分别为P＜0.05和P＜0.01);B细胞表面Fas的表达降低(P＜0.01);CD4+T细胞bcl-2的表达下降(P＜0.01).②活动期SLE患者血中B细胞的凋亡率明显下降,CD8+T细胞数较正常对照组增加,CD4+T细胞低于常人(分别为:P＜0.01、P＜0.05和P＜0.01).结论 SLE患者体内淋巴细胞凋亡的异常与T、B细胞表面Fas和bcl-2基因表达的异常有关.

r-HuEPO对慢性肾衰患者红细胞免疫功能的影响

已证实红细胞具有识别、粘附、杀伤抗原、清除免疫复合物及参与机体免疫调控等功能[1].我们观察了重组人类红细胞生成素(r-HuEPO)对慢性肾衰(CRF)患者红细胞免疫功能的影响,证明r-HuEPO具有纠正CRF患者的贫血,提高红细胞免疫功能的作用.1 材料和方法1.1 研究对象 CRF患者90例,均为住我院的患者,男46例,女44例,平均年龄(45.5±11.5)岁.其原发病有:慢性肾炎(54例)、急进性肾炎(3例)、原发性高血压(9例)、糖尿病(15例)及多囊肾(9例),均符合CRF的诊断标准.正常对照组78例,为体检中未发现患有肾脏疾病的体检者,男45例,女33例,平均年龄(39.3±3.8)岁.

小鼠肺癌细胞与树突状细胞融合的研究

目的使肺癌细胞表达共刺激分子,探讨其作为疫苗的可能性.方法小鼠骨髓细胞在体外经GM-CSF和TNF-α诱导,使之成为成熟树突状细胞(BmDC).将其与小鼠Lewis肺癌细胞系AL9901融合,并以S-P免疫细胞化学染色法检测融合细胞和BmDC上有关分子的表达.结果通过GM-CSF和TNF-α诱导获得BmDC,以诱导5d时收获为佳.获得的BmDC能高表达B7-1和CD40分子,与肺癌细胞融合后,获得的融合细胞仍能高表达B7-1和CD40分子.结论通过将小鼠肺癌细胞与树突状细胞融合,使肺癌细胞获得了BmDC表达的B7-1和CD40分子,从而提高了其免疫原性,为制备肺癌疫苗奠定了基础.

急性胰腺炎患者血清IL-8和INF-α含量的变化

急性胰腺炎是临床常见疾病,其发病主要与胰酶消化自身组织有关.近年来,细胞因子和免疫功能紊乱与急性胰腺炎的关系日益受到重视[1].IL-8和TNF-α在机体的炎症反应过程中发挥着重要的作用,也可能与急性胰腺炎发生发展的病理过程有关[2],但目前这方面的研究尚不多见.为此,我们检测了56例急性胰腺炎患者血清IL-8和TNF-α的含量,并探讨了其在急性胰腺炎发生发展中的作用和临床意义.

地塞米松对视网膜色素上皮细胞IL-6表达的抑制作用

目的观察视网膜色素上皮(RPE)细胞中,IL-6的表达及地塞米松对IL-6表达的抑制作用.方法培养的人RPE经IL-1β(10 μg/L)刺激及地塞米松作用后,采用ELASA、免疫组化和原位杂交等方法,检测培养的人RPEIL-6 mRNA及其蛋白的表达.结果用IL-1β刺激后8 h,RPE细胞表达的IL-6约为2 000 ng/L@106细胞;地塞米松可明显抑制IL-6蛋白的产生(200 ng/L@106细胞),与对照组相比较差异显著(P＜0.01).免疫组化染色显示,表达的IL-6在RPE细胞胞浆中呈浓淡不一的棕黄色,地塞米松作用组染色较浅.原位杂交表明,IL-6 mRNA在RPE细胞胞浆中的表达呈浓淡不一的紫蓝色,地塞米松作用组染色与对照组相同.图像分析显示,二者的吸光度(A)值无明显差别(P＞0.05).结论在IL-1β刺激下,人RPE细胞可表达IL-6的mRNA及其蛋白,地塞米松能有效地抑制RPE细胞中IL-6蛋白的表达.

骁悉对系统性红斑狼疮患者免疫功能的影响

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种累及多系统、多脏器的自身免疫性疾病.其发病机制复杂,治疗难度大.传统的治疗方法通常是采用皮质类固醇与环磷酰胺和硫唑嘌呤等免疫抑制剂联合.虽然对病情的控制有一定的作用,但增加了感染、骨髓抑制和发生恶性肿瘤等的危险性.为探索治疗SLE的新途径,我们应用新型免疫抑制剂骁悉(cellcept)治疗了30例SLE患者,并观察了骁悉对SLE患者免疫功能的影响.

脱敏治疗与阻断性封闭抗体的关系

过敏性疾病的脱敏治疗是一种能有效缓解过敏症状的方法,但缺少评价疗效的客观指标.我们对34例过敏性疾病患者进行脱敏治疗后,检测了其血清中阻断性封闭抗体,并用10例正常人作对照进行分析.1 材料和方法1.1 研究对象过敏性疾病患者均为本院变态反应室专科门诊患者,共34例,男21例,女13例,病程6个月～25年,年龄为9～56岁.其中过敏性鼻炎患者25例,均符合变应性鼻炎诊断标准及疗效评定标准[1];过敏性哮喘9例,系根据患者症状及体征而确诊.以上34例的过敏原均为粉尘螨,并曾用粉尘螨浸液进行脱敏治疗,疗程由4个月～8年不等.

不同年龄正常人血清抗角蛋白自身抗体水平的分析及意义

目的分析不同年龄段正常人血清抗角蛋白自身抗??(anti-keratin autoantibody, AK auto Ab)的水平与年龄的相关性,并探讨AK auto Ab产生的可能机制.方法以人角蛋白进行包被,采用间接 ELISA 法检测新生儿脐带血、幼儿、成年人及老年人血IgM与IgG类AK auto Ab的水平,并进行Kruskal-Wallis秩和检验分析.结果脐带血IgM和IgG类AK auto Ab的水平,均明显低于其它年龄组(P＜0.05);而幼儿脐带血及成年人、老年人血清IgM和IgG类AK auto Ab的水平无明显差异(P＞0.05).结论出生时AKauto Ab即存在但水平较低,幼年期AK auto Ab的水平迅速增加,以后各年龄段基本保持稳定.

兔肺肿瘤模型射频消融术后血清sIL-2R的变化

目的探讨恶性肺肿瘤射频消融(RFA)术后的免疫刺激作用及血清中sIL-2R的变化.方法采用肿瘤细胞VX2悬液种植法建立肺肿瘤模型,进行RFA后,观察原发灶及肿瘤的转移情况,并测定血清sIL-2R的水平.结果 RFA治疗后的原发灶生长缓慢,sIL-2R的水平下降,腹腔淋巴结转移率低于对照组.结论 RFA后,肿瘤坏死分解产物可刺激机体免疫系统,增强免疫功能.

以汉坦病毒重组核衣壳蛋白为抗原进行ELISA血清分型的研究

目的以汉坦病毒重组核衣壳蛋白(NP)为抗原,对陕西、河北两省部分地区HFRS患者的血清进行ELISA分型.方法用5种汉坦病毒NP为抗原,建立一种间接ELISA法,并检测上述地区患者血清中特异性IgG.结果陕西、河北两省部分地区汉坦病毒的感染以血清型HTN为主,其次为SEO型,并检测出2例疑似DOB型感染的血清.结论用汉坦病毒NP作抗原进行ELISA血清分型是可行的,并首次发现我国存在DOB血清型的免疫学证据.

肾炎患者尿液单个核细胞尿激酶受体的表达及其意义

尿液中的免疫活性细胞与肾小球肾炎的发生、发展具有直接关系,而尿激酶受体(urokinase receptor,u-PAR)作为淋巴细胞活化抗原,在肾小球肾炎尿液中单个核细胞(UMC)的表达情况及其意义尚不清楚.我们采用流式细胞仪,对107例肾炎患者的尿液进行了分析并探讨了其意义.

食管鳞状上皮细胞癌及癌旁组织中HPV11 L1基因克隆及序列比较

目的克隆食管癌组织和癌旁组织中HPV11型主要衣壳蛋白L1基因,并比较两个序列间的同源性.方法以食管癌组织和癌旁组织纯化的总DNA为模板,根据HPV11型L1基因的保守区分段设计引物.分两段扩增HPV 11基因,克隆入质粒载体中,pGEM-3Zf(-)以双脱氧法双向测定目的片段的序列,并拼接出该片段的全序列,比较两个序列间的同源性,以及与已知基因序列的差异性.结果从1例食管癌患者食管癌组织和癌旁组织中,分别克隆到1株HPV11型L1的编码序列M1和M2,两序列间的同源性极高,仅在个别位点存在差异.与GenBank中登录的HPV序列NC001525.1(HPV-11)、M14119.1(HPV-11)和AF217526.1(HPV-11)相比较大部分相同.结论成功地构建了HPV11型L1基因上游片段pGEM-3Zf(-)和下游片段pGEM-3Zf(-)的重组克隆,为深入研究HPV的感染与食管癌发病机制的关系奠定了基础.

抗血小板膜糖蛋白单抗SZ-21嵌合Fab片段基因的构建和表达研究

目的为降低抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-2l的免疫原性,克隆了SZ-21可变区基因,构建并表达人-鼠嵌合Fab基因工程抗体.方法利用基因克隆技术,从杂交瘤细胞系SZ-21克隆出轻、重链可变区基因,然后亚克隆到质粒pSW1中,构建成人-鼠嵌合Fab片段基因质粒pSZ-21,在大肠杆菌中表达.结果 pSZ-21基因构建正确,在大肠杆菌中表达出可溶性抗体片段,表达产物具有与血小板结合的活性.结论成功地克隆了SZ-21可变区基因,并表达了可溶性人-鼠嵌合Fab基因工程抗体.

抗LPS mAb Fab片段的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的构建抗LPS单克隆抗体Fab段的真核表达载体,并在CHO细胞中表达.方法以逆转录PCR方法扩增抗LPS mAb重链Fd和轻链cDNA,分别克隆入载体pGEM-T easy.经测序分析后,再分别亚克隆入载体pcDNA3,构建成重组载体pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC,并以PCR方法扩增pcD-NA3-LC中包括CMV启动子、轻链序列和BGH Poly(A)在内的轻链表达序列.经适当的限制性内切酶酶切后,插入到质粒pcDNA3-Fd中Fd表达序列的前部,构建成表达载体pcD-NA3-Fab,以脂质体包裹转染CHO细胞.经G418筛选,用ELISA、免疫荧光和Western blot鉴定阳性克隆.结果用ELISA和免疫荧光法,筛选出4株高表达Fab的细胞株.Western blot显示,表达产物的Mr为50 000.同时,ELISA结果显示,该Fab具有良好的结合LPS的活性.结论成功地在CHO细胞中表达抗LPS mAb的Fab段,为进一步鉴定其抗LPS的作用,使之成为诊断和治疗革兰氏阴性细菌感染的工具奠定了基础.

抗人红细胞血型A抗原单链抗体原核表达及活性测定

目的构建并表达抗人红细胞血型A抗原单链小分子抗体(single-chain Fv)蛋白.方法设计合成抗重、轻链可变区引物,通过重叠延伸拼接PCR技术,在50A mAb VH和VL基因间引入连结短肽,体外构建50A ScFv基因并进行序列分析;将其克隆入表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中诱导表达;并以免疫印迹测定重组蛋白的生物学活性.结果序列分析表明,50A ScFv基因全长747 bp,编码249个氨基酸;重组体表达产物聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,融合蛋白的相对分子质量(Mr)为29 000左右,与预期的结果一致,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在;光密度扫描结果表明,重组蛋白占菌体总蛋白的16.2%,免疫印迹试验显示,重组小分子抗体保留了亲本mAb的特异性亲和力.结论成功地构建50A ScFv基因,并在原核细胞中获得较高水平的表达,为进一步研制基因工程血型检定抗体奠定了基础.

CD3/CD22双特异性单克隆抗体的研制

双特异性单克隆抗体(BsAb)是在单克隆抗体(mAb)基础上研制成的一种新型抗体,其特点是一个BsAb分子可同时识别两种不同的抗原决定簇.采用BsAb再导向效应细胞治疗肿瘤,是近年来较有希望的一种特异性免疫疗法[1].另外,也可用于免疫学检测和基础研究,实用性强.BsAb的制备有杂交瘤细胞融合技术、化学交联法和基因工程技术.我们采用杂交瘤技术,成功地研制出2株分泌CD3/CD22BsAb的四源杂交瘤细胞,并对其进行了特异性鉴定及再导向生物学活性的测定.

用噬菌体展示六肽库筛选与具有结合活性的小分子多肽

目的筛选与人重组G-CSF分子有结合活性的小分子多肽.方法将靶分子G-CSF固定在塑料平皿上,对随机噬菌体六肽库进行3轮筛选.经孵育、洗脱、扩大培养和ELISA分析,随机挑取出第3轮得到的4个阳性克隆测序,然后进行同源性比较.结果找到1个保守性肽段序列模式"SXXRVX”,此模式在人和小鼠的受体中都未见到其同源序列.结论此小肽可与G-CSF结合,故在一定程度上有可能抑制G-CSF与受体的结合,为临床治疗炎症反应和研究G-CSF与受体相互作用的机制提供了一定的帮助.

重组人血管生长素及其单克隆抗体的特性鉴定

目的鉴定自制重组人血管生长素(rhANG)及其单克隆抗体(mAb).方法采用凝胶扫描法分析rhANG的纯度;ELISA等方法检测抗rhANG mAb的特异性,鸡胚绒毛尿囊膜实验检测rhANG及其mAb的生物学活性,并与商品化标准品的免疫结合性进行对比研究.结果 rhANG的纯度达96%,具有促进血管生长的生物学活性;抗ANG mAb具有很好的特异性和抑制血管生长的活性;而且二者较标准品均具有良好的免疫结合活性.结论该rhANG及其mAb可用于进一步的实验和临床应用研究.

抗角蛋白16单克隆抗体对角质形成细胞增殖活性的影响

目的研究抗角蛋白单克隆抗体(mAb)对体外培养的角质形成细胞增殖活性与细胞周期的影响.方法以无血清培养基体外原代培养角质形成细胞.应用3H-TdR掺入DNA合成测定法,观察抗角蛋白16 mAb(anti-K16 mAb)对角质形成细胞代谢增殖的影响.用流式细胞仪分析anti-K16mAb作用后角质形成细胞的细胞周期变化.结果 mAb作用后,角质形成细胞样品的cpm降低,并呈抗体剂量依赖方式.流式细胞仪分析表明,处于S期的细胞比例由27%上升至42.2%,同时处于G1期与G2期的细胞比例分别相应下降.结论 anti-K16 mAb可抑制体外培养的角质形成细胞的增殖活性,且将细胞阻滞于S期,无法进入G2期与M期分裂增殖.

抗体包被免疫磁珠的研制及其应用

1979年,John Ugelstad等[1]成功地制备了一种均匀性和粒度适宜的聚苯乙烯微球.将其磁化并与抗体连接后,即成为一种分离细胞效果极佳的免疫磁珠-Dynabeads.从此,免疫磁珠得到广泛应用[2,3],并引发了生物分离技术上的一次革命.免疫磁珠的主要特点有:(1)分离速度快、效率高、可重复性好;(2)操作简单、不需要昂贵的仪器设备;(3)不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能.迄今,我国尚没有生产高质量免疫磁珠的能力,而进口磁珠的价格昂贵,因而限制了免疫磁珠在我国生物医学研究领域中的应用.我们在综合了国内外新相关技术的基础上,建立了一种合成免疫磁珠的新方法,所获产品的表面特性及分离效果均较良好.

Tris-SDS-PAGE测定多肽的相对分子质量

急、慢性肾小球肾炎患者血清一氧化氮水平的观察

一氧化氮(NO)是一种细胞内和细胞间重要的信使分子,具有广泛的生物学活性,可参与和调节体内多种生理和病理活动[1].NO与肾小球的关系已有报道,但意见不一.为了探讨NO与急、慢性肾小球肾炎之间的关系,我们对55例患者血清NO的水平进行了测定,以期为急、慢性肾小球肾炎的诊治提供依据.1 材料和方法1.1 研究对象疾病组:分为急性肾小球肾炎组(A组)和慢性肾小球肾炎组(B组),均为按1985年南京第二届全国肾病学术会议讨论修订的肾小球疾病诊断标准选择的病例.A组16例,男9例,女7例,平均年龄37岁.B组39例,男24例,女15例,平均年龄36.4岁.B组又按SCr值分为:①肾功正常组(B1组,n=12,SCr＜178μmol/L);②氮质血症组(B2组,n=17,178μmol/L≤P＜SCr≤445μmol/L);③尿毒症组(B3组,n=10,SCr＞445μmol/L).另外,同时选择同期年龄、性别相匹配的健康体检者20名作为对照组,均无心、肝和肾等重要脏器疾患.

测定淋巴细胞增殖的MTS和XTT比色法的建立

目的建立用新型四唑氮盐MTS和XTT做比色分析测定淋巴细胞增殖效应的方法.方法分别用MTS、XTT结合PMS,对小鼠脾淋巴细胞密度和增殖进行比色测定,选择佳实验条件,并将这两种方法与3H-TdR掺入法和MTT法比较.结果用MTS和XTT比色分析法测定小鼠脾淋巴细胞的增殖,在0.5～4×109/L的范围内,所获光吸收(A)值与细胞密度呈良好的相关性.佳细胞密度为2×109/L,佳反应时间为6 h,佳PMS的终浓度为1×10-4mol/L.两种比色法与3H-TdR掺入法的结果相一致,且两种新方法较MTT法灵敏.结论 MTS和XTT比色分析法可代替3H-TdR掺入法和MTT法,用于测定淋巴细胞的增殖效应.

组织细胞中胶原蛋白的提取及ECL-Western blot分析

目的建立一种可简便、有效的胶原蛋白提取、纯化及型别分析的测定方法.方法用破碎、酶解和盐析3步法提纯胶原,用ECL-Western blot测定细胞基质胶原(200例)、正常组织及工程化修复组织中的胶原(30例).结果该法提取胶原的时间周期短,得率高于传统方法的2.5倍,纯度达到了PAGE纯化的水平.结论该法具有简便、快速、灵敏和无放射性污染等优点,为组织工程胶原的深入研究提供了有价值的测试手段.

肿瘤的主动免疫治疗

由于分子生物学的发展,基因操作技术的进步,特别是肿瘤特异性抗原的确定,持续了近百年的肿瘤免疫治疗,特别是主动免疫治疗,近几年有了突破性进展.目前,肿瘤的主动免疫治疗,更确切地说应该是肿瘤的免疫基因治疗,已推进到Ⅲ期临床实验,给患者带来了切实的好处,使患者有了新的希望.相信在不久的将来,肿瘤的主动免疫基因治疗的研究与应用,将在我国蓬勃发展起来.