细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位： 中国免疫学会；第四军医大学
- 主办单位： 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子： 0.81
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1007-8738
- 国内刊号： 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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重组P53基因转染的肝癌细胞ICAM-1分子的表达
细胞间黏附分子-1(ICAM-1)又称CD54, 是免疫球蛋白超家族中的单链跨膜球蛋白, 其表达受多种因素(如自身免疫病、创伤、白血病及细胞因子等)的影响[1-4].ICAM-1与细胞迁移至炎性部位有关, 也具有协同刺激T细胞功能的作用, 在淋巴细胞活化及免疫应答过程中起重要作用[5], 但也有助于淋巴细胞与肿瘤细胞之间的相互作用.P53基因是一种肿瘤抑制基因, 对细胞增埴分化起重要的调节作用.50%的人类肿瘤中发现P53基因有缺失或突变[6].我们观察了抑癌基因P53对人肝癌细胞株HepG-2上ICAM-1分子表达的调节作用.
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类胰蛋白酶抑制剂对人大肠肥大细胞组胺释放的影响
目的: 研究类胰蛋白酶抑制剂(TPI)对人大肠肥大细胞释放组胺的影响.方法: 大肠组织经胶原酶和透明质酸酶消化后, 将细胞成分用全HBSS重新悬浮.肥大细胞在LP4试管中于37℃条件下与各种刺激剂反应15 min而完成激发过程.激发液中的组胺水平用以玻璃纤维为基础的荧光方法测定.结果: 4种TPI中, 高浓度的亮抑酶肽素和鱼精蛋白可刺激人大肠肥大细胞释放组胺; 而TLCK和乳铁蛋白则无明显的刺激作用.4种TPI均可以剂量依赖的方式抑制抗IgE抗体诱导的大肠肥大细胞释放组胺. 大浓度的亮抑酶肽素(200 mmol/L)、 TLCK(100 mmol/L)、乳铁蛋白(30 mmol/L)和鱼精蛋白(100 mg/L), 可分别抑制48.7%、 36.7%、 40.2%和34.1%的组胺释放.在37℃条件下, 将4种TPI同大肠肥大细胞预培养20 min, 与未进行预培养相比较, 它们对抗IgE抗体诱导的组胺释放无明显改变.4种TPI还可抑制CI诱导的组胺释放, 抑制范围在25%～32%之间.与抗IgE抗体诱导的组胺释放则不同, 与大肠肥大细胞预培养20 min, 与未进行预培养相比较, 亮抑酶肽素和TLCK对CI诱导的组胺释放的抑制作用明显增强; 而鱼精蛋白则无此作用.结论: 我们首次发现TPI可抑制人大肠肥大细胞IgE抗体依赖和非IgE抗体依赖的组胺释放, 提示TPI可望成为炎症性肠病或其他肥大细胞相关疾病治疗的一个新途径.
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可溶性PD-1协同HSP70-肽复合物抑制荷瘤小鼠肝癌的研究
目的: 研究基因转染和表达的可溶性PD-1(soluble programmed death-1, sPD-1)对HSP70-肽疫苗抗肿瘤效果的影响及协同机制.方法: 以HSP70-肽疫苗免疫BALB/c小鼠后, 用半定量RT-PCR技术检测和分析HSP70-肽疫苗对小鼠脾细胞上PD-1及其配体基因表达的影响.体内转染表达sPD-1, 用MTT比色法检测HSP70-肽疫苗免疫小鼠对肿瘤生长的抑制作用以及脾淋巴细胞的细胞毒活性.结果: 单独的sPD-1就有抗肿瘤效应.HSP70-肽疫苗不仅能预先在动物体内诱导肿瘤特异性的CTL, 而且可使脾细胞上抑制性共刺激受体PD-1及其配体的表达显著升高.用sPD-1与HSP70-肽疫苗联合治疗荷瘤小鼠, 能提高脾CTL的杀伤效率并延长HSP70-肽疫苗的免疫效果.结论: sPD-1可通过阻断PD-1与其配体的结合作用, 及减弱PD-1的负反馈抑制作用, 而增强HSP70-肽疫苗的抗肿瘤效应.
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HBeAg与CD81分子结合的研究
目的: 研究HBeAg与CD81分子在细胞内、外的相互作用.方法: 应用RT-PCR技术, 从HepG2细胞中扩增CD81全基因, 并构建重组真核表达载体.将其与pGBKT7-eAg共转染营养缺陷型酵母细胞, 观察生长情况.应用网织红细胞裂解体外翻译及免疫共沉淀试验, 进一步验证CD81分子与HBeAg的结合. 结果: 经EcoR I和BamH I酶切和DNA序列测定鉴定表明, 构建的CD81基因的重组表达载体正确.共转染后的酵母细胞在营养缺陷的培养基中生长良好.体外免疫共沉淀试验证实, CD81与HBeAg出现沉淀带. 结论: HBeAg与CD81分子在细胞内、外均可结合, 推测CD81在HBV的致病过程中起着重要的作用.
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重组质粒pYTA/Aβ-HBcAg的构建及其在大肠杆菌中的表达
目的: 研究β-淀粉样肽(Aβ)与HBcAg的融合基因Aβ-HBcAg的原核表达, 并检测表达的融合蛋白Aβ-HBcAg的免疫原性. 方法: 从重组质粒7Z/Aβ-HBcAg中, 切下含Aβ-HBcAg的基因片段, 将其融合于质粒pYTA1的lac启动子之后, 构建重组表达质粒pYTA/Aβ-HBcAg.以此重组质粒转化大肠杆菌DH5α, 在IPTG诱导下表达.超声破碎表达的细菌, 通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色, 检测融合蛋白Aβ-HBcAg的表达.采用ELISA法检测融合蛋白的反应原性. 融合蛋白经饱和硫酸铵盐析法分离和纯化后免疫BALB/c小鼠, 用ELISA法检测血清中抗-Aβ抗体的滴度.结果: 融合蛋白以可溶性形式存在于细菌裂解液的上清中, 其表达量为菌体总蛋白量的7% .表达的融合蛋白既有Aβ的反应原性, 又有与HBcAg的反应原性.经3次免疫后, BALB/c小鼠血清中抗-Aβ抗体的滴度高可达为1∶ 16 000.结论: 融合基因Aβ-HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达. 表达产物为可溶性蛋白, 存在于细菌裂解液的上清中, 具有较强的免疫原性.本研究为正在进行的AD基因工程疫苗的动物实验打下了基础.
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可调控性鼠PLP-Ig嵌合体重组腺病毒载体的构建和表达
目的: 构建和表达可调控鼠蛋白脂质蛋白(PLP)-免疫球蛋白重组腺病毒载体.方法: 采用常规分子生物学方法, 从WT-1杂交瘤细胞中抽提总RNA,克隆小鼠Ig重链Fc基因.将编码PLP139-151的DNA与信号肽设计在引物上, 经两次克隆可形成可分泌型PLP-Ig.经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接, 鉴定后在HEK293细胞中包装.获得高滴度病毒后, 用Western blot鉴定目的基因的表达.结果: PLP-Ig重组腺病毒经测序、限制性内切酶酶切分析及PCR等鉴定, 同预期结果相一致.Western blot检测病毒感染的细胞, 发现目的基因得到特异性表达且可被四环素调节.结论: 构建了可调控的小鼠PLP-Ig重组腺病毒载体并得到正确表达, 为进一步基因治疗实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)和诱导免疫耐受奠定了基础.
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大剂量γ线照射对小鼠免疫功能近期、远期的影响
目的: 观察大剂量γ线照射对小鼠免疫功能近期、远期的影响.方法: 将225只清洁级C57小鼠, 随机分为0、 6、 9、 12、 15和20 Gy 6个剂量组, 经γ线全身1次照射后, 于照后1～28 d和3～12月活杀取材, 用原位末端标记(TUNEL)和May-Grunwald-Giemsa(MGG)染色, 检测细胞凋亡并观察其与照射剂量的关系.用流式细胞仪检测外周血T细胞亚群的变化.结果: (1)照后早期(1～14) d外周血淋巴细胞的凋亡率即出现明显升高, 随着照射剂量的增加凋亡率的升高更为显著; 而T细胞亚群经不同剂量照射后持续下降, 剂量为20 Gy时降至低, 其中以CD8+ T细胞对辐射的敏感性高, 因而推测早期的严重损伤是急性辐射免疫损伤的重要特点之一.(2)照射后1月淋巴细胞的凋亡率降低, T细胞及其亚群也逐渐恢复.然而直至照后6～12月, 无论是淋巴细胞的凋亡率还是CD3+ T细胞及CD8+ T细胞亚群, 均未恢复到对照的水平, 提示大剂量辐射对机体免疫系统的损伤呈现较重的远期效应.(3)本实验还发现, 12≤ Gy照射后, 外周血淋巴细胞的凋亡率与照射剂量呈明显的剂量效应关系, 15～20 Gy照射后未观察到明显的量效关系.结论: 照射后早期外周血淋巴细胞的大量凋亡, 可能是导致T细胞亚群的百分率急剧下降和后期免疫功能受损的重要原因.本研究为急性重度放射病的治疗和探索核事故患者的生物剂量提供了重要依据.
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人PD-L1 cDNA的克隆及其胞外区蛋白在大肠杆菌中的表达
目的: 克隆人PD-L1基因的cDNA并构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体, 在大肠杆菌中进行表达.方法: 以RT-PCR法从活化的人淋巴细胞总RNA中, 扩增并克隆PD-L1的cDNA, 构建PD-L1胞外区基因的原核表达载体, 在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定.结果: 克隆到PD-L1 cDNA编码区的全长序列, 经DNA测序证明其与已报道的序列一致.同时构建了在羧基端带有His6标签的PD-L1胞外区基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达.免疫印迹分析表明, 在IPTG诱导后表达的PD-L1胞外区蛋白, 相对分子质量(Mr)为25 000, 与理论值的大小相符.该重组蛋白能与抗His6标签的单抗(mAb)特异性反应.结论: 成功地克隆PD-L1基因, 其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达, 为利用PD-L1转基因修饰移植物或以PD-L1重组蛋白抑制移植排斥反应等研究提供了条件.
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CpG寡脱氧核苷酸增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答
目的: 探讨CpG 寡脱氧核苷酸(ODN)增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答效果.方法: 选用环磷酰胺(CTX)所致免疫抑制模型小鼠, 以乙肝疫苗和20 μg CpG ODN联合或单独左胫前肌肌注免疫C57BL/6小鼠.2 wk后以同样剂量加强免疫1次, 再过3 wk后摘除眼球取血, 用ELISA法检测抗-HBs IgG抗体和IL-12的水平.同时, 无菌取脾脏做HE染色, 观察脾脏淋巴细胞的数量和细胞核的变化.结果: CpG ODN与疫苗联合注射组产生的绝对抗体量比单独注射疫苗组提高1倍; 注射组产生IL-12的水平较单独注射疫苗组也有明显升高.光镜下各组脾脏淋巴细胞的变化如下: 正常对照组脾脏可见大量的淋巴细胞; 与正常对照组相比较, CTX组的淋巴细胞明显稀少; 而CTX加CpG组的淋巴细胞数明显增多, 细胞核也明显增大.结论: CpG ODN能增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答.
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C3bAN42与OVA257-264融合基因的构建及表达产物生物学活性的鉴定
目的: 探讨补体系统在T细胞活化中的作用.方法: 构建补体组分C3活化片段C3b的受体结合片段C3bAN42与OVA257-264 CTL表位融合基因表达质粒, 并对融合蛋白的表达以及生物学活性进行检测.结果: 以重组质粒转染COS-7细胞后, 用FACS检测融合蛋白在COS-7细胞中得到表达.将转染细胞的培养上清与巨噬细胞系Ana-1共孵育, 通过激光共聚焦显微镜扫描观察, 发现融合蛋白可与Ana-1发生特异性结合, 并且重组的融合蛋白被Ana-1细胞内吞后, 可释放出表位肽OVA257-264.后者与MHC-Ⅰ类分子结合后, 以OVA257-264- MHC-Ⅰ类分子复合物的形式被交叉呈递于Ana-1细胞的表面.结论: C3bAN42与OVA257-264 CTL表位融合基因在真核细胞中能正确表达, 且重组的融合蛋白具有其天然的生物学活性.
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结核分枝杆菌Ag85B与IL-12基因真核共表达质粒的构建及表达
目的: 构建结核分枝杆菌Ag85B和鼠IL-12基因的共表达载体pBud85B-IL12.方法: 将结核分枝杆菌Ag85B基因和鼠IL-12基因同时克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4.1中, 构建真核共表达质粒pBud85B-IL12.以pBud85B-IL12转染COS-7细胞, 通过RT-PCR及ELISA方法检测目的基因的表达.结果: 在COS-7细胞中同时可检测到Ag85B和IL12的表达.结论: pBud85B-IL12共表达质粒的成功构建, 为对其免疫原性、免疫反应性及免疫保护作用的进一步研究奠定了基础.
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大肠杆菌脂多糖2630模拟位的研究
目的: 利用纯化的抗大肠杆菌L2630多抗筛选噬菌体环七肽库, 以获得可模拟脂多糖(LPS)表位的短肽克隆. 方法: 以亲和层析纯化的抗大肠杆菌L2630多克隆抗体为靶分子, 筛选噬菌体随机环七肽库, 用双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆的抗原性. 结果: 对噬菌体环肽库进行3轮筛选后, 随机挑选20个克隆, 经鉴定其中12个可与抗L2630抗体结合, 即为阳性克隆; 其中有5个阳性噬菌体克隆表现出与抗鼠伤寒沙门氏菌LPS多抗结合的活性, 提示这5个噬菌体展示的短肽具有模拟大肠杆菌LPS及鼠伤寒沙门氏菌LPS共同表位的性质.经DNA序列分析显示, 其中8个克隆的氨基酸序列具有X-DGLL-XX或X-EDGLL-X保守序列, 其余4个克隆的序列均不相同. 结论: 筛选获得的噬菌体环七肽克隆具有模拟大肠杆菌LPS表位的活性, 为大肠杆菌L2630多表位模拟短肽.其中5个阳性噬菌体克隆短肽具有模拟大肠杆菌LPS及鼠伤寒沙门氏菌LPS共同表位的活性.
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口服免疫耐受大鼠脾淋巴细胞对肾小球系膜细胞中NF-κB p65活性的影响
目的: 探讨口服免疫耐受大鼠脾淋巴细胞对肾小球系膜细胞中NF-κB p65活性的影响.方法: 将10只6～8 wk龄雌性Wistar大鼠随机分为两组, 每组5只.一组用Fx1A抗原灌胃诱导其产生免疫耐受, 另一组用PBS灌胃作为对照组.2 wk后, 杀鼠取脾、分离淋巴细胞进行抗原特异性淋巴细胞增殖实验.制备免疫耐受大鼠脾淋巴细胞培养上清, 用夹心ELISA法测定其中IL-10的水平.将体外培养的系膜细胞用高水平的胰岛素, 同时加入大鼠的脾淋巴细胞培养上清作用24 h.用免疫组化染色及夹心ELISA法检测系膜细胞中NF-κB p65的活性. 结果: 与对照组大鼠相比较, 口服免疫耐受组大鼠抗原特异性脾淋巴细胞的增殖明显受到抑制, 其脾淋巴细胞培养上清中IL-10的水平明显升高(P＜0.01).在体外实验中发现, 口服免疫耐受大鼠脾淋巴细胞培养上清, 可抑制胰岛素刺激的系膜细胞内NF-κB p65的活性(P＜0.05). 结论: 口服免疫耐受大鼠的脾淋巴细胞, 可能通过其分泌的IL-10抑制系膜细胞内NF-κB p65的活性.
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宫颈癌中p27基因的表达及其临床意义
目的: 探讨宫颈癌中p27蛋白的表达及其临床意义. 方法: 用免疫组化链霉亲合素-过氧化物酶染色法(SP法), 检测22例正常宫颈组织和48例宫颈鳞癌组织中p27蛋白的表达.结果: 宫颈癌组织中p27蛋白表达的阳性率为39.5%, 而正常宫颈组织中的表达率为72.7%, 两者差异显著(P<0.01).另外, p27蛋白在宫颈癌组织中表达的阳性率, 与癌细胞的分化程度、患者的临床分期以及有无淋巴结转移有关.癌细胞分化程度低、晚期患者及有淋巴结转移者, p27蛋白表达的阳性率低, 反之则高.结论: p27蛋白表达的阳性率与宫颈癌的分化程度、临床分期及有无淋巴转移有关.检测p27蛋白的表达可作为判定宫颈癌病情的参考指标.
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NF-κB在大鼠急性肺损伤模型肺组织中的表达及N-乙酰半胱氨酸的影响
目的: 检测NF-κB在LPS诱导的急性肺损伤(ALI)肺组织中的表达, 以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对ALI的抑制作用.方法: 采用免疫组化染色(ABC法)和Western blot, 检测NF-κB在急性肺损伤大鼠气道和肺组织中的表达, 以及NAC干预后活性NF-κB表达的变化.结果: 正常对照组大鼠气道黏膜上皮和肺间质中, 仅见少量散在的NF-κB核阳性细胞; 而LPS诱导ALI后, 气道黏膜、肺间质、肺泡腔及血管内皮细胞中NF-κB核阳性的细胞明显增多(P<0.01).NF-κB核阳性反应细胞主要为气道黏膜上皮细胞、浸润的炎症细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞.NAC治疗组NF-κB核阳性细胞较LPS诱导的ALI组及对照组均明显减少(P<0.01).Western blot的结果显示, LPS诱导的ALI后不同时间点, NF-κB的表达不同, 于急性肺损伤3 h达高峰.各时间点NF-κB的表达均较正常对照组高.结论: LPS诱发的大鼠急性肺损伤的气道和肺组织内NF-κB的表达增加, 肺组织内的多数细胞参与了NF-κB的激活.NAC可通过抑制NF-κB的激活减轻急性肺损伤的炎症程度.
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HFRS患者血浆中TNF、sIL-2R、IL-6、IL-4和IFN-γ水平的变化及其意义
目的: 探讨肾综合征出血热(HFRS)患者血浆中的TNF、 sIL-2R、 IL-6、 IL- 4和IFN-γ水平的变化及其与血清中丙氨酸转氨酶ALT活性水平的相关性.方法: 利用双mAb夹心ELISA法检测HFRS患者血浆中细胞因子的水平, 应用美国RA-1000全自动生化仪检测患者血清中ALT的水平.结果: HFRS患者血浆中TNF、 IL-6、 IL- 4、 IFN-γ和sIL-2R水平分别为(95.82±12.04)、 (362.46±141.26)、 (17.76±3.52)、 (116.18±19.80) ng/L及(898 820±127 200) U/L, 健康对照组依次为(17.89±1.68)、 (43.81±18.08)、 (4.86±1.14)、 (7.57±2.41) ng/L及(66 730±29 690) U/L、 (P<0.01); 患者血清中ALT的水平也显著升高, 为正常对照的4.4倍.通过相关性分析, 发现TNF、 sIL-2R、 IL-6和IFN-γ水平与患者血清中ALT的水平高度相关(P<0.01).结论: HFRS患者体内TNF、 sIL-2R、 IL-6和IFN-γ水平显著升高, 且与患者体内ALT水平的升高高度相关, 提示HTNV感染所致肝脏的损伤可能与上述细胞因子水平的升高有关.
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慢性冬眠心肌组织中血管紧张素II受体表达的变化
目的: 探讨慢性冬眠心肌(CHM)组织中血管紧张素II 1型受体(AT1R)和2型受体(AT2R)的变化及意义.方法: 10只中国家猪(乳猪), 随机分为实验组(n=6)和假手术组(n=4), 以免疫组化染色法检测CHM组织中AT1R和AT2R在细胞上的表达及含量的变化.结果: (1)假手术组心肌(Sham)、实验组正常心肌(normal myocardium, NM)及冬眠心肌(CHM)中, AT1R均表达于心肌细胞和血管平滑肌细胞上; AT2R在Sham及NM中仅表达于心肌细胞上, 而在CHM中除心肌细胞外, 血管平滑肌细胞上亦表达AT2R.(2)Sham与NM中血管紧张素受体含量无差别, CHM中AT1R的含量降低, AT2R的含量升高.结论: 冬眠心肌中AT1R含量的降低及AT2R蛋白含量的升高和AT2R在血管平滑肌中的再表达, 可能参与了CHM形成和进展过程.
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GM-CSF对MUC1基因疫苗抑制乳腺癌生长的增强作用
目的: 观察GM-CSF有无增强MUC1基因疫苗对EMT6乳腺癌生长的特异性抑制作用. 方法: 采用股四头肌肌肉注射法, 将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1-MUC1免疫雌性BALB/c小鼠, 每3 wk 1次, 共3次.每次基因免疫后1、 3、 5 d, 皮下注射GM-CSF 100 μL(1 μg/100 μL).后1次基因免疫后第3周, 接种表达MUC1的EMT6小鼠乳腺癌细胞.两周后观察、记录肿瘤的生长情况.于肿瘤细胞接种后第43天, 处死全部动物, 称量肿瘤的质量.用4 h 51Cr释放法检测小鼠脾特异性CTL的杀伤活性. 结果: 接种肿瘤细胞后43 d, MUC1基因疫苗加GM-CSF组、 MUC1基因疫苗组、 pcDNA3.1加GM-CSF组及pcDNA3.1组, EMT6肿瘤的大小依次为(135±33.8)mm3、 (250±34.3)mm3、 (568±43.6)mm3和(596±48.2)mm3; 平均瘤质量(g) 依次为(0.81±0.42)g、 (1.23±0.41)g、 (2.30±0.48)g及(2.28±0.58)g .与对照组相比较, MUC1基因疫苗组EMT6肿瘤的生长受到明显抑制(P<0.05); 与单独MUC1基因疫苗组相比较, MUC1基因疫苗加GM-CSF组抗肿瘤生长的作用有显著差异(P<0.05).在效靶比为100∶ 1、 50∶ 1、 25∶ 1和12.5∶ 1时, MUC1基因疫苗加GM-CSF组特异性CTL对EMT6靶细胞的杀伤率, 依次为68.5%、 53.4%、 35.9% 和28.5%; MUC1基因免疫组依次为54.1%、 39.8%、 26.4%和20.1%, pcDNA3.1加GM-CSF及pcDNA3.1两个对照组分别为13.2%、 10%、 8.2%、 7.2% 和11.7%、 9.8%、 7.7%、 7.0%, MUC1加GM-CSF组与单独MUC1基因免疫组相比较差异显著(P<0.05).结论: GM-CSF可显著增强MUC1基因疫苗对EMT6乳腺癌生长的特异性抑制作用.
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狼疮性肾炎患者外周血中IL-18的表达以及FK506、CsA和DEX的抑制作用
目的: 探讨IL-18在活动性狼疮性肾炎(LN)患者中的表达以及免疫抑制剂FK506、环孢霉素A(CsA)和地塞米松(DEX)对其表达的抑制作用.方法: 取16例活动性LN患者和10例正常人空腹静脉全血, 分为未刺激组、脂多糖/植物血凝素(LPS/PHA)刺激组、 LPS/PHA+FK506组、 LPS/PHA+CsA组和LPS/PHA+DEX组在体外培养24 h, 采用ELISA法检测培养上清中IL-18的水平, 应用半定量的RT-PCR检测全血培养细胞中IL-18 mRNA的表达, 以及FK506、 CsA和DEX对其表达的抑制作用.结果: 活动性LN患者全血培养的细胞自发及以LPS/PHA刺激后, IL-18 mRNA和其蛋白的表达显著高于正常对照组(P<0.01); FK506、 CsA和DEX对LPS/PHA刺激的LN患者全血培养细胞IL-18 mRNA及其蛋白表达的抑制作用明显大于对正常对照组的抑制作用.结论: IL-18 在活动性LN患者LN的发病机制中可能起着重要的作用, 抑制IL-18的产生有望成为活动性LN治疗的一个新途径.
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HBsAg与恒定链融合基因真核表达载体的构建及鉴定
我国是乙型病毒肝炎的高发国家,约有1.2亿有HBV携带者,而原发性肝癌中90%的患者有HBV感染[1].研究者发现,72.7%的肝癌旁组织及45%的肝癌组织中可检出HBsAg,故其可作为肝炎后肝癌患者免疫治疗的相对特异的"肿瘤相关分子"[2].
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多天线癌胚抗原检测方法的建立及其在恶性肿瘤患者血清中的水平
目的: 建立多天线癌胚抗原(multiple antennae carcinoembryonic antigen, MA-CEA)的快速定量检测法, 并研究肿瘤患者血清中多天线癌胚抗原的水平.方法: 采用神经氨酸酶(neuraminidase, NMD)降解MA-CEA糖链外侧的唾液酸.采用蔓陀萝凝集素(datura stramonium agglutinin, DSA)和CEA抗体, 建立检测MA-CEA的链霉亲和素-生物素系统酶免疫分析法(ABC-EIA), 分别检测239例肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和卵巢癌患者血清中MA-CEA的水平, 同时采用ELISA检测血清CEA的水平.结果: 血清MA-CEA的水平在CEA阳性的肺癌患者中明显升高, 75例肺癌患者血清MA-CEA的阳性率为14.7%, 而CEA水平升高的肺癌阳性率为47.3%; 但胃癌、肝癌、结肠癌和卵巢癌患者, 无论CEA水平是否升高, 均未检测到MA-CEA水平的升高.结论: 建立了一种可定量检测肿瘤患者血清MA-CEA的方法, 为肺癌的鉴别诊断及其他多天线糖链肿瘤标志物的研究奠定了基础.
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人VEGF165基因真核表达质粒的构建及其对血管内皮细胞增殖的影响
目的: 构建人VEGF165基因的真核表达质粒pBudCE4.1/VEGF165, 观察其在血管内皮细胞(VEC)中的表达和表达产物对VEC增殖的影响.方法: 用RT-PCR法从引产胎儿心脏组织中克隆VEGF165基因, 并将其克隆至真核表达质粒pBudCE4.1中, 对重组真核表达质粒pBudCE4.1/VEGF165进行酶切鉴定和测序.以脂质体转染法将pBudCE4.1/VEGF165导入VEC中, 用Northern blot和免疫细胞化学染色法, 分别从mRNA水平和蛋白质水平检测它们在转染的VEC中的表达, 并检测表达产物对VEC增殖的影响.结果: 人VEGF165基因的RT-PCR产物为576 bp.测序结果显示, 扩增的VEGF165基因的序列与基因文库中登录的序列完全一致.经Hind Ⅲ和BamH I酶切鉴定证实, VEGF165基因已成功地克隆至真核表达质粒pBudCE4.1中.以其转染血管内皮细胞(VEC)后, 经Northern blot杂交和免疫细胞化学染色法检测均证实VEGF165基因表达.表达产物对VEC增殖有明显的促进作用.结论: 所构建的pBudCE4.1/VEGF165真核表达质粒可在VEC中表达, 表达产物可明显促进VEC增殖, 为通过VEGF165基因转染防治移植器官内血管的狭窄奠定了基础.
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小鼠肺纤维化模型中基质金属蛋白酶-9及其抑制剂表达水平的变化
目的: 研究小鼠博来霉素在肺纤维化模型中肺泡巨噬细胞(AM)分泌的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的表达随着时间的变化, 观察肺纤维化中MMP-9和TIMP-1的表达是否存在失衡. 方法: 以博来霉素诱导建立小鼠肺纤维化模型, 采用HE染色观察肺部胶原沉积状况.选用抗CD68 mAb, 采用微小免疫磁珠法分离纯化肺泡灌洗液中的AM, 用Hoechst 33258染色AM, 在下光镜高倍视野计数法评估AM的纯度和活性, 用EIA法检测AM上清液中MMP-9和TIMP-1的表达.结果: 肺组织切片HE染色显示小鼠肺部胶原沉积在1、 3、 7、 14、 28 d呈逐渐加重趋势.粗分离的AM纯度为(82.5±2.5)%. 采用微小免疫磁珠法分离肺泡灌洗液中的AM纯度可达到(99.3±0.7)%(P<0.05). 纯化后的细胞存活率为(92.5±1.8)%, 与纯化前的(92.7±2.0)%, 相差不大(P>0.05).随着小鼠肺间质纤维化的进展, MMP-9的分泌量逐渐减少, 而TIMP-1的表达量逐渐增加.结论: 在小鼠肺纤维化中AM分泌的MMP-9和TIMP-1之间存在失衡, 表明基质降解系统受到抑制.
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肝细胞癌组织中端粒酶逆转录酶基因hTERT的表达不依赖PCNA和P53
目的: 研究肝细胞癌(HCC)中端粒酶逆转录酶基因hTERT的表达及其与增殖细胞核抗原(PCNA)和P53基因的关系, 探讨其在HCC发生、发展及预后复发中的意义.方法: 采用免疫组化染色法检测42例HCC组织中hTERT、增殖细胞核抗原(PCNA)和P53蛋白的表达, 并对hTERT与HCC的临床病理特征以及PCNA、 P53蛋白表达的关系进行分析.结果: HCC中hTERT、 PCNA和P53蛋白的阳性率, 分别为71.4%(30/42)、 76.2%(32/42)、 73.8%(31/42); 而hTERT在正常肝脏组织中不表达.hTERT在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级HCC组织中的表达率, 分别为40.0%(4/10)、 70.0%(14/20)及100%(12/12).HTERT的表达率与疾病复发有显著相关性(P<0.05).结论: hTERT表达的异常可能与肝癌的发生、发展有关.hTERT与PCNA和P53无明显的相关性.检测hTERT的表达可作为预测肝癌预后复发的潜在指标, 并提示HCC为由多基因参与的疾病.
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人活体小肠部分移植术后的实验室监测
目的: 报告国内首例人活体小肠部分移植术后实验室检测结果, 讨论实验室检测的作用和临床意义.方法: 定时进行肝功能、肾功能、心肌酶谱、脂类、 C-反应蛋白(CRP)、血细胞分析及D-木糖等项目的连续检测.结果: 术后(18 d)实验室异常结果基本恢复正常范围.11月22日(第67天)Tbil从6.2 升高到26.4 μmol/L, GGT从正常升高到2 872 nkat/L, ALP从正常升高到2 872 nkat/L, 小肠吸收率试验D-木糖, 从25.6%降至16.8%, 血清白蛋白从46.4 g/L降至31.2 g/L, 其余肝功能指标在正常范围.血细胞分析: 典型嗜酸性粒细胞为0.08, 反应性嗜酸性粒细胞为0.26, 总计数为0.34, 中性粒细胞核右移, 细胞胞膜有溶解现象, 嗜中性粒细胞中毒颗粒为0.09, 血红蛋白下降.按急性免疫排斥反应治疗, 11月26日上述实验室异常结果均基本恢复正常范围.结论: 实验室结果对各脏器的功能评估、对早期急性免疫排斥反应提供了依据和对感染等并发症也有重要临床意义.
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抗rhEPO单克隆抗体的制备及初步应用
目的: 研制抗人促红细胞生成素的特异性单克隆抗体(mAb), 对其生物学特性进行初步鉴定, 并用于转基因羊乳中重组人促红细胞生成素(rhEPO)的提纯.方法: 以自制的rhEPO粗品免疫BALB/c小鼠, 制备抗rhEPO 的mAb.以Western blot和间接ELISA法, 对所获mAb进行初步鉴定.以纯化的mAb同预活化的Sepharose- 4B偶联, 制得mAb亲和层析柱, 并用于转基因羊乳中rhEPO的提纯. 结果: 获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞株(1E7和2E6).Ig亚类(型)的鉴定分别为IgG1 和IgG2b, 轻链均为κ型.用Western blot证实, 获得的mAb可特异性地识别rhEPO.用自制的免疫亲和层析柱用于转基因羊乳中rhEPO的提纯, 具有很好的吸附作用, 回收率达70%.结论: 成功地获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞.用自制的免疫亲和层析柱提纯转基因羊奶中的rhEPO具有较高的吸附效率.
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抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体基因的构建、初步筛选和鉴定
目的: 构建抗木瓜凝乳蛋白酶全套单链抗体(scFv)噬菌体表面展示文库.方法: 从木瓜凝乳蛋白酶免疫小鼠的淋巴细胞中提取总RNA, 反转录成cDNA后, 用抗体V区简并引物扩增全套VH和VL基因.经重叠延伸反应, 装配成scFv基因, 并将其克隆到噬粒载体pFAB5C中, 构建scFv噬菌体抗体库.对抗体库进行亲和筛选后, 用ELISA法鉴定抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv.结果: 经4轮"亲和-吸附-洗脱"的富集过程, 得到ELISA活性较高可与木瓜凝乳蛋白酶结合的克隆.结论: 成功地构建了抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv噬菌体展示文库, 并筛选到与木瓜凝乳蛋白酶具有结合能力的scFv基因.
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抗人角蛋白全IgG基因真核表达载体的构建及表达
目的: 构建抗角蛋白抗体基因的真核表达载体, 并在CHO(dhfr-)细胞中表达.方法: 从含抗角蛋白抗体基因的原核Fab表达载体中, 扩增VH 及VL基因.以回收的PCR产物为模板, 用重叠PCR扩增带有前导序列的VH、 VL基因. 经Xba I/BamH I和Xho I/Hind III酶切后, 分别插入真核表达载体pWD中, 构建重组载体pWDκH. 经PCR和测序鉴定正确后, 用lipofectAMINE 2000转染CHO(dhfr-)细胞.取培养上清检测抗人角蛋白全IgG的表达.结果: 构建了抗人角蛋白基因的真核表达载体pWDκH, 并在CHO(dhfr-)细胞中表达.结论: 在CHO(dhfr-)细胞中成功地表达了具有抗原结合活性的抗人角蛋白IgG, 为其临床应用奠定了基础.
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抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定
目的: 建立分泌抗HIV-1 p24单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株, 并对其特性进行初步鉴定. 方法: 以纯化的基因工程制备的p24抗原免疫BALB/c小鼠, 取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合, 经HAT、 HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后, 用间接ELISA法及Dot blot对其进行筛选和特性鉴定.结果: 筛选到2株可分泌抗HIV-1 p24 mAb的杂交瘤细胞, 其腹水效价为1×10-5, 亲和力为1.7×104～1.8×104 mol/L, mAb的Ig亚类均为IgG1.两株mAb与HBcAg、 HCV RNA 阳性血清及HIVgp41等均无交叉反应, 只与HIV-1 p24抗原阳性血清产生特异反应. 结论: 成功地建立了2株可分泌抗HIV-1 p24 mAb的杂交瘤细胞, 为进一步研制HIV-1 p24抗原的ELISA检测试剂盒奠定了基础.
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抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的: 制备抗禽流感病毒(AIV)H9亚型血凝素蛋白的单克隆抗体(mAb).方法: 以AIV H9亚型油乳剂灭活疫苗作为免疫原, 免疫8 wk龄BALB/c小鼠.采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗AIV H9亚型血凝素蛋白的mAb; 采用ELISA和血凝抑制试验(HI)检测腹水mAb的效价; 采用ELISA、 HI、免疫荧光染色(IF)及Western blot鉴定mAb的特异性.结果: 获得3株可稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞株2A3、 2H1和1C8, 其腹水mAb的ELISA效价依次为1×107、 1×105和5×106, 血凝抑制效价为1×28～1×213; 3株mAb的Ig亚类均为IgG1.以mAb 2H1进行Western blot的结果显示, 该mAb能与AIV的Mr为75 000的蛋白条带起反应, 表明其是针对AIV H9亚型血凝素蛋白的mAb.与32株AIV H9亚型国内分离株进行血凝抑制试验表明, mAb 2H1具有良好的广谱性.结论: 成功地制备了抗AIV H9亚型血凝素蛋白的mAb, 为AIV的抗原性分析、血清学诊断、疫苗质量的监测及流行病学调查等奠定了基础.
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抗汉坦病毒NP抗原细胞内抗体的瞬时表达及活性检测
目的: 在真核细胞中表达抗汉坦病毒NP抗原鼠源性单克隆抗体(mAb) 1A8的scFv, 并检测表达产物的活性.方法: 将真核表达载体1A8-scFv-Cκ/pCI-neo用脂质体转染COS-7细胞, 用间接免疫荧光和免疫共沉淀法检测瞬时表达产物的免疫学活性.结果: 间接免疫荧光的结果表明, 约1%细胞胞质中出现弥散荧光, 在免疫共沉淀/免疫印记中, 表达的抗体片段可与汉坦病毒的NP抗原特异性结合.结论: 细胞内表达的1A8-scFv-Cκ可与NP抗原特异性结合, 为进一步研究细胞内抗体的抗病毒功能奠定基础.
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噬菌体展示抗体文库的研究进展
噬菌体展示技术(Phage display techniques)兴于20世纪90年代初.该技术能将目的的基因表达的多肽或蛋白质展示在噬菌体表面,并保持目的蛋白(或多肽)相对独立的空间结构和生物学活性.
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兔抗人Bit1抗血清的制备及其纯化
目的: 利用大肠杆菌中表达的人Bit1(hBit1)蛋白, 制备兔抗人Bit1抗血清并对其进行纯化. 方法: 在大肠杆菌中诱导表达人Bit1融合蛋白.以其免疫家兔, 制备兔抗人Bit1抗血清, 用非特异性去除法纯化抗体, 并以Western blot 对所纯化的兔抗人Bit1抗血清进行鉴定. 结果: 大肠杆菌中表达的人Bit1蛋白占菌体总蛋白的40%.用纯化的抗血清可特异地检出大肠杆菌表达的人Bit融合蛋白.结论: 人Bit1融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达, 并成功地制备并纯化了兔抗人Bit1抗血清.
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葡萄球菌D型肠毒素超抗原TCR Vβ结合位点的研究
目的: 研究金黄色葡萄球菌D型肠毒素(SED)超抗原与TCRVβ结合的关键位点.方法: 利用定点突变技术, 构建了6种SED的突变体. 用3 H-TdR掺入法检测这些突变体促进T细胞增殖的活性. 对促增殖活性降低的突变体, 进一步用流式细胞仪检测他们与MHC-Ⅱ类分子结合的活性和其TCRVβ特异性.结果: 发现N23位氨基酸是SED与人TCRVβ5结合的关键位点.H26位氨基酸可能是SED与人的其他TCRVβ(除TCRVβ5、 TCRVβ8和TCRVβ12.1)结合的关键位点, 值得进一步研究.结论: 本结果丰富了对超抗原免疫识别的认识, 为葡萄球菌超抗原相关疾病的防治, 以及基于超抗原设计新的抗肿瘤免疫制剂提供了理论依据.
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人胚胎神经干细胞向神经元分化过程中Notch1基因的表达
目的: 探讨Notch1基因在全反式维甲酸(ATRA)诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元过程中的表达及其发挥的作用.方法: 用不同浓度(0.5、 1、 5和10 μmol/L)的ATRA在体外诱导人胚胎神经干细胞, 7 d后, 做NSE免疫荧光染色, 计数分化为神经元的比例.用1 μmol/L的ATRA诱导人胚胎神经干细胞, 于诱导前、诱导3 d和诱导7 d, 提取细胞的总RNA, 用半定量RT-PCR法检测Notch1基因的表达.结果: 与对照组相比较, ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例(P<0.01).其中1 μmol/L的ATRA诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例高, 为(29.20±1.09)%.Notch1基因在ATRA诱导后表达明显下调(P<0.001).结论: ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例, Notch1基因在人胚胎神经干细胞分化为神经元的过程中表达量下调.
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人乳头瘤病毒18型L1-E6、E7嵌合基因DNA疫苗的体内免疫效应
目的: 检测HPV 18 L1-E6、 E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应.方法: 将实验动物BALB/c小鼠54只随机分为9组, 按不同免疫方式(肌肉接种或鼻内滴注)分别给予不同的重组质粒(pVAX1-L1-E6M3或pVAX1-L1-E7M3)和免疫佐剂(pLXHDmB7-2或LTB).用免疫原免疫3次, 末次免疫后取眼球后血进行ELISA抗体检测.末次免疫后进行小鼠足垫迟发型超敏反应(DTH)试验.断足进行小鼠足垫HE染色.取小鼠脾脏制成单细胞悬液, 进行脾细胞增殖试验, 并进行CD4+/CD8+ T细胞中IFN-γ+或IL- 4+细胞的FACS分析.结果: 与对照组相比, 各实验组均获得明显的免疫效果.实验组免疫后血清抗体A值均高于相应组别免疫前; 肌肉注射组每次免疫后抗体水平较前次明显升高.实验组小鼠注射VLP抗原的左后足垫局部有红肿硬结, 镜下观察可见大量单核细胞侵润.肌肉接种组的DTH反应强度、脾细胞增殖刺激指数(SI)和CD8+ IFN-γ+细胞数均高于鼻内滴注组; 而鼻内滴注组CD4+ IL- 4+细胞数高于单纯质粒肌肉接种组; 加入pLXHDmB7-2的联合免疫组各项指标均高于单纯质粒组.结论: 证实了重组pVAX1-HPV18 L1/E6、 E7嵌和基因DNA疫苗能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫效应.同时, 证实B7-2分子能显著提高该质粒在小鼠体内的免疫反应效果.
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致死剂量的γ线照射后小鼠胸腺淋巴细胞的凋亡规律及与bax、bcl-2和Bcl-XL表达的关系
目的: 观察致死剂量γ线照射后小鼠胸腺淋巴细胞凋亡特征及与Bax、 Bcl-2和Bcl-XL蛋白和mRNA表达的关系, 为急性重度以上放射病的治疗提供依据.方法: 清洁级C57小鼠250只, 随机分为0、 6、 9、 12、 15和20 Gy 6个剂量组. 经γ线全身1次照射后, 于照射后1～28 d和3～12个月, 活杀取胸腺和外周血, 用原位末端标记(TUNEL)和麦格-姬姆萨(MGG)染色检测胸腺淋巴细胞的凋亡; 用原位杂交和碱性磷酸酶免疫组化染色法, 检测Bax、 Bcl-2和Bcl-XL mRNA 和其蛋白的表达.结果: (1)各剂量组小鼠外周血白细胞在照射后6 h, 出现一过性的升高, 以后迅速下降.6 Gy照射后7 d降至低, 至照射后28 d基本恢复到正常水平.(2)不同剂量的γ线照射后24 h, 胸腺淋巴细胞的凋亡率迅速升高; 在6～12 Gy范围内与照射的剂量呈正比, ≥15 Gy照射后变化不明显.(3)6 Gy照射后24 h, 胸腺淋巴细胞的凋亡率达高峰, 而后开始降低; 但直至照射后6个月和12个月, 凋亡率仍明显高于对照组.(4)6 Gy照射后3 h, 胸腺淋巴细胞中Bax蛋白的表达即出现增加, 至24 h达峰值, 显示出时效关系; 而Bcl-2蛋白于照射后3 h即明显下降, 24 h降至低; Bcl-XL蛋白也在照射后24 h降至低.bax和bcl-2 mRNA的检测与蛋白水平的检测一致.结论: 经6～12 Gy照射后, 淋巴细胞的凋亡与照射剂量成正比, ≥15 Gy照射后凋亡率下降, 提示≤12 Gy照射后胸腺淋巴细胞的凋亡是其死亡的主要方式.促凋亡蛋白Bax表达的增加及抗凋亡蛋白Bcl-XL表达的下降, 与照射剂量和淋巴细胞的凋亡率呈现较好的对应关系, 提示它们在致死剂量的照射所致胸腺淋巴细胞凋亡的调控中起着重要作用.
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高渗盐水处理对失血性休克兔红细胞免疫黏附功能及抗细菌感染的影响
目的: 探讨高渗盐水处理, 对失血性休克兔红细胞免疫黏附功能和对大肠杆菌攻击抵抗力的影响.方法: 将60只兔分为6组, 每组10只, 第1组为假休克组: 仅在局麻下插管加肝素; 第2、 3组经颈动脉放血导致兔休克.30 min后, 第1、 2组兔分别给予生理盐水及含1×109/kg大肠杆菌的平衡盐液; 第2组兔给予75 g/L盐水及含1×109/kg大肠杆菌的平衡盐液, 然后观察3组动物的存活率.另取兔30只, 分组和失血性休克模型的制作同上, 但处理所用的平衡盐液中不含大肠杆菌.以C3b受体花环及IC花环形成实验, 检测休克后5 h兔红细胞的免疫黏附功能.结果: 高渗盐水处理组兔红细胞C3b受体花环的形成率显著高于生理盐水治疗组(P<0.01); 而IC 花环形成率则显著低于生理盐水处理组(P<0.01).另外, 高渗盐水处理能显著提高失血性休克兔对大肠杆菌攻击的抵抗力.结论: 高渗盐水处理能显著增强失血性休克兔的红细胞免疫黏附功能和对大肠杆菌攻击的抵抗力.
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人上皮细胞黏附分子融合蛋白真核表达载体的构建、表达及初步鉴定
目的: 构建pIg-EpCAM及pEGFP-EpCAM真核表达载体, 并在COS7细胞中表达.方法: 用PCR扩增EpCAM cDNA, 酶切后分别与pIg及pEGFP两种载体连接, 用脂质体法转染COS7细胞.用免疫沉淀法检测pIg-EpCAM的表达产物; 用荧光显微镜观察EpCAM-GFP的表达.结果: DNA序列测定的结果显示, pIg-EpCAM及pEGFP-EpCAM载体的构建正确.免疫沉淀的结果显示, 转染pIg-EpCAM的COS7细胞的培养上清中含有相对分子质量(Mr)为65 000的融合蛋白, 该蛋白与抗人IgG Fc段的mAb具有良好的免疫反应性.荧光显微镜观察可见, 转染空载体pEGFP的COS7细胞中绿色荧光均匀地分布于胞质和胞核; 而转染pEGFP-EpCAM的COS7细胞中绿色荧光主要分布于细胞表面.结论: 成功地构建了两种EpCAM的真核表达载体, 并在COS7细胞中表达, 为EpCAM的功能研究创造了条件, 并为制备抗EpCAM的mAb提供了免疫原.
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当归多糖对小鼠腹腔巨噬细胞释放细胞效应分子的诱导作用
目的: 观察当归多糖对小鼠腹腔巨噬细胞产生细胞毒效应分子的影响.方法: 从BALB/c小鼠的腹腔分离巨噬细胞, 并进行原代细胞培养.采用MTT比色法及紫外分光光度法, 检测当归多糖对腹腔巨噬细胞释放一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、活性氧(ROS)以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和溶菌酶(LSZ)活性的影响.结果: 当归多糖可激活巨噬细胞释放NO、 TNF-α和ROS等效应分子, 并显著提高LSZ的活性.当归多糖可能通过提高巨噬细胞iNOS的活性而增加NO的释放量, 但其与脂多糖(LPS)无协同促进NO释放的作用.当归多糖体外无直接杀伤肿瘤细胞的作用, 但其与巨噬细胞共孵育的培养上清具有杀伤L929细胞的作用.结论: 当归多糖可促进巨噬细胞释放NO、 TNF-α及ROS等细胞效应分子, 并可通过作用于巨噬细胞而促进TNF-α的分泌, 发挥间接的抗肿瘤免疫作用.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 |
| 1995 | 01 02 03 |
| 1994 | 01 02 |
| 1993 | 01 02 03 04 |
| 1992 | 01 02 03 04 |
| 1991 | 01 02 03 04 |
| 1990 | 01 02 |
| 1989 | 01 02 03 04 |
