细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位: 中国免疫学会;第四军医大学
- 主办单位: 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子: 0.81
- 审稿时间: 1-3个月
- 国际刊号: 1007-8738
- 国内刊号: 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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TNF-α在中子及γ线照射小鼠肠组织中的表达
目的: 比较小鼠经中子及γ线照射后,肠组织中TNF-α的表达及其意义.方法: 350只二级雄性BALB/c小鼠, 经不同剂量的中子和γ线照射,于照后6、12 h,1、2、3、4、5、7、10、14、21、28 d分批活杀,采用免疫组化染色等技术观察TNF-α在肠组织中的变化.结果: 在正常肠黏膜中, TNF-α主要见于肠绒毛间质、黏膜下及淋巴组织中巨噬细胞浆内; 2.5Gy中子照后2 d内, 上述阳性部位TNF-α的表达进行性减少; 3~7 d其在巨噬细胞及隐窝细胞浆内的表达明显增加, 5 d达高峰, 14 d恢复至正常水平. 4.0、5.5Gy中子及12Gy γ线照射后4 d内,TNF-α的表达进行性减少; γ线5.5Gy照后6~12 h, TNF-α的表达增多,照后1 d减少, 2~5 d增加, 3 d达高峰,10 d恢复至正常水平.TNF-α的表达在肠黏膜损伤时减少, 于损伤后恢复的早期增多.结论: 中子和γ线照后,肠内源性TNF-α表达具有不同的变化规律,并参与了肠放射损伤及修复的病理生理过程.
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TNF-α含量的改变与肾小管细胞缺氧-复氧性损伤关系的研究
目的: 探讨TNF-α含量的改变与肾小管上皮细胞株(HK-2)缺氧-复氧性损伤的关系.方法: 以HK-2细胞株作为研究材料,采用液体石蜡覆盖法建立缺氧损伤模型, 分别在缺氧4、12、24 h和复氧4、12、24 h,采用放射免疫分析法(RIA)、生化法和台盼蓝拒染法,检测培养液中TNF-α的含量、乳酸脱氢酶(LDH)的活性、细胞计数及活细胞率的改变.结果: 缺氧后4 h, TNF-α的含量、LDH的活性开始升高,细胞总数及活细胞计数开始下降, 并于缺氧后24 h达高峰.TNF-α含量的改变与LDH 活性的升高呈显著的正相关(r=0.89,P<0.05),与活细胞计数的下降呈显著的负相关(r=-0.91, P<0.05).结论: 肾小管缺氧-复氧后,TNF-α的产生增多, 并参与了肾小管细胞损伤的过程.
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人IL-24基因的克隆、 表达、 纯化及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究
目的: 克隆人白细胞介素-24(IL-24)基因, 在大肠杆菌中融合表达,纯化复性,研究此融合蛋白的抗肿瘤活性.方法: 分离人外周血单个核细胞, ConA刺激培养, 提取细胞总RNA, RT-PCR技术克隆人IL-24基因.将IL-24插入到pET32a(+)中,构建重组表达载体IL-24/pET32a,IPTG诱导在E.coli表达.Edman法N端测序,将鉴定正确的蛋白亲合层析纯化.MTT比色法体外分析杀伤肿瘤细胞的活性.结果: 获得人IL-24基因,序列分析与GenBank公布一致.表达载体用双酶切和PCR鉴定正确.重组工程菌经IPTG诱导后表达相对分子质量(Mr)约为35 000 的融合蛋白.N端测序正确, 鉴定该蛋白以包涵体形式表达.包涵体经洗涤、溶解后,亲合纯化得到纯度大于95%的融合蛋白.复性后表达产物能显著诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡(P<0.05).结论: IL-24融合蛋白在原核细胞中高效表达,并获得高纯度、在体外明显诱导乳腺癌细胞凋亡的重组蛋白,为后续的研究提供实验基础.
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血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用
目的: 证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用.方法: 采用脂质体介导的DNA转染技术, 以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304, 再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子.并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响.结果: ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1.NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%, 两者差异具有显著意义(P <0.01).结论: HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应.
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TNF-α和IFN-γ刺激的人脐静脉内皮细胞上IgG受体的表达
目的: 检测IgG受体(FcγR)在炎症细胞因子刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上的表达.方法: 采用ELISA、免疫组化染色法、免疫荧光法和RT-PCR等方法, 检测 FcγRII及其表达.结果: 未经细胞因子刺激的正常HUVEC可表达低水平的FcγRIIa; 经2×105 U/L TNF-α和1×105 U/L IFN-γ联合刺激3 d后, FcγRIIa的表达提高16倍(P<0.01).免疫荧光法检测显示, TNF-α和IFN-γ诱导的FcγRIIa表达于HUVEC表面.RT-PCR结果显示, FcγRIIa mRNA表达量在TNF-α和IFN-γ刺激24 h后有明显提高.结论: TNF-α和IFN-γ可通过调节FcγRIIa的转录和翻译, 增强其在HUVEC上的表达.FcγRIIa的表达可能与血管炎条件下, 免疫复合物在血管上的特异性定位有关.
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汉滩病毒核蛋白T细胞表位的鉴定及其特异性T细胞应答规律的初步探讨
目的: 鉴定引起肾综合征出血热(HFRS)的汉滩病毒核蛋白(HTNV-NP)的T细胞表位, 并探讨其特异性T细胞应答的规律.方法: 合成覆盖HTNV-NP全长序列的全套部份重叠15肽, 用ELISPOT方法筛选能刺激HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC)产生IFN-γ的15肽,并测定其特异性T细胞的频率.结果: 47例HFRS患者中,有18例可对HTNV-NP产生特异性T细胞应答, 并发现在病程的早期就已开始产生T细胞应答.从11例患者PBMC中, 鉴定出了17种HTNV-NP特异的T细胞表位,其中14种T细胞表位为首次报道,T细胞表位主要位于NP一级结构的中部.结论: HFRS病程早期即可产生特异性T细胞应答, T细胞表位主要位于NP序列的中部, T细胞应答可能在汉滩病毒感染过程中起重要的免疫保护作用.
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优化密码子提高草原兔尾鼠ZP3融合蛋白的原核表达
目的: 探讨提高草原兔尾鼠(Lagurus lagurus)卵透明带3 (LZP3)基因在原核细胞中表达的水平.方法: 利用重叠PCR技术, 定点突变LZP3基因上3个稀有的密码子簇, 将LZP3基因中7个稀有的密码子更换成大肠杆菌(E.coli)常用的相应密码子.将获得的LZP3突变基因(LZP3m)插入pGEX4T-1中, 构建重组表达载体.以重组体转化E.coli BL21(DE3)菌株进行表达.结果: LZP3m基因的表达量比野生型LZP3基因明显提高.结论: 通过密码子优化, 能显著提高LZP3基因在原核细胞中的表达水平.
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白藜芦醇对小鼠T细胞活化、增殖及细胞因子分泌的影响
目的: 研究白藜芦醇(RSV)对小鼠T淋巴细胞增殖及细胞因子分泌的影响, 为阐明其免疫抑制作用提供实验依据.方法: 无菌分离小鼠淋巴结细胞, 加入不同浓度的RSV预先孵育1 h, 用多克隆刺激剂佛波醇酯和离子霉素刺激T细胞活化增殖.采用 3H-TdR掺入法检测RSV对T细胞增殖的影响; 用RT-PCR检测IL-2及IFN-γ mRNA的表达; 用胞内细胞因子染色法分析IL-2和IFN-γ的分泌.结果: RSV能抑制T细胞增殖, 也能在mRNA水平及蛋白水平上抑制IL-2及IFN-γ的分泌.结论: RSV对T细胞的免疫抑制作用, 可能与其抑制T细胞的活化、增殖和细胞因子的分泌有关.
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幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的构建及鉴定
目的: 克隆幽门螺杆菌 Hp ureB基因,并构建其核酸疫苗.方法: 以 Hp NCTC11637株基因组DNA为模板, 用PCR扩增ureB基因,并亚克隆至pMD18-T载体中.将目的基因经 Sal I、Bgl Ⅱ酶切纯化后插入pTCAE中, 转化 E.coli DH5α.经 Sal I、Xho I酶切并测序鉴定的阳性重组质粒命名为pT-ureB.以电穿孔法将pT ureB转染CHO细胞, 用Western blot检测UreB蛋白的表达.结果: 克隆重组后得到pT-ureB.将pT-ureB以电穿孔法转染CHO细胞后, 取其培养上清进行Western blot检测,在UreB的相对分子质量( M r)为 62 000 处出现特异性条带.结论: 成功地构建了 Hp ureB核酸疫苗.体外转染CHO细胞后,经Western blot检测证实有UreB蛋白的表达,为进一步的相关研究奠定了基础.
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人TIM-3在真核细胞的表达及稳定转染细胞株的建立
目的:构建人TIM-3真核表达载体, 在真核细胞中表达人TIM-3, 建立稳定转染细胞株.方法:设计特异性引物, 利用PCR技术扩增出TIM-3全编码区基因片段, 插入到真核表达载体pIRES2EGFP中, 重组质粒pIRES2EGFP-hTIM-3用脂质体转染法转染哺乳动物细胞, 以流式细胞术(FCM)和Western blot分析蛋白质的的表达, 借助FCM和选择性培养基筛选建立稳定转染细胞株.结果:成功构建了pIRES2EGFP-hTIM-3真核表达载体, 转染哺乳动物细胞COS-7和CHO后, FCM和Western blot分析证实TIM-3高效表达于细胞膜表面, 建立了稳定转染的CHO细胞株.结论:成功构建了人TIM-3真核表达载体, TIM-3高效表达在转染的哺乳动物细胞表面, 并建立了稳定转染的细胞株.为进一步研究TIM-3及其配体的生物学功能以及制备和筛选抗人TIM-3 mAb提供了条件.
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人sCD40L-Ig重组腺病毒载体的构建、表达及功能检测
目的: 构建含有分泌型人胞外区CD40L融合蛋白(sCD40L-Ig)基因的重组腺病毒载体,确定其表达和功能学意义.方法: 通过PCR获得人源IgGFc和sCD40L基因并予以连接,将其插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中, 构建重组质粒pAdTrack-sCD40L-Ig.将其与pAdEasy-1-BJ5183菌行同源重组后,用293细胞包装,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western blot分析等方法鉴定重组腺病毒,并进行双向混合淋巴细胞反应(MLR)以确定其功能.结果: 所构建的sCD40L-Ig基因的重组腺病毒, 经酶切和PCR鉴定正确.原代腺病毒的滴度达到2.69×1011 pfu/L, 并有相对分子质量(Mr)为61×103的目的蛋白表达.MLR显示,重组腺病毒对淋巴细胞的增殖有抑制作用.结论: 成功地构建了含有sCD40L-Ig基因的重组腺病毒,并对MLR有抑制作用.
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TGFβ1对肺成纤维细胞中转录因子SP1、 AP1和Smad3-Smad4活性的影响
目的: 检测转化生长因子β1(TGFβ1)对大鼠肺成纤维细胞(RLF)中转录因子SP1、AP1和Smad3-Smad4活性的影响并探讨其意义.方法: 进行大鼠肺成纤维细胞的原代分离培养, 应用10 μg/L TGFβ1进行处理,通过凝胶阻滞电泳(EMSA)、免疫印迹和免疫组化染色等方法,检测照射后转录因子SP1、AP1和Smad3 Smad4活性的变化及Ⅰ型胶原和Ⅰ型组织纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitorⅠ, PAI-1)表达的变化.结果: 正常RLF中AP1和Smad3-Smad4形成弱阻滞条带,SP1无阻滞条带形成.以10 μg/L TGFβ1处理后, 3种转录因子所形成的阻滞条带明显增强, PAI-1和Ⅰ型胶原的表达增多.结论: 一定浓度的TGFβ1可促进RLF中转录因子SP1、AP1和Smad3 Smad4的活化,并进而增加PAI-1和Ⅰ型胶原的表达.
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人β2微球蛋白基因启动子的克隆及其在P815细胞中的活性研究
目的: 克隆人β2微球蛋白(β2m)基因启动子,并研究其在小鼠肥大细胞瘤细胞P815中对下游报告基因的启动活性.方法: 用PCR法从基因组内扩增β2m基因启动子.通过基因重组的方法, 构建含此启动子的EGFP基因真核表达载体, 然后分别瞬时和稳定转染P815细胞.通过 RT PCR、荧光显微镜摄像和流式细胞术分析, 观察IFN-γ作用前后EGFP的表达.结果: 从基因组内扩增出302 bp的人β2m基因的启动子, 成功地构建了含此启动子的真核报告载体.RTPCR的结果表明, IFN-γ对启动子的活性具有诱导作用, 且呈浓度依赖性.流式细胞术的结果显示,在5×10 5 U/L IFN-γ作用下,尽管表达EGFP的细胞数量没有差异, 但刺激组EGFP的表达强度是未刺激组的2倍.结论: 人β2m基因启动子在小鼠肥大细胞瘤细胞P815中具有高度的启动活性.通过该启动子中所含干扰素刺激反应元件(ISRE),可在IFN-γ诱导作用下调控下游目的基因的表达.
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抗VEGF中和抗体对II型胶原诱导的关节炎形成的影响
目的: 了解抗血管内皮生长因子(VEGF)中和抗体对Ⅱ型胶原(CoⅡ)诱导的关节炎(CIA)形成的影响.方法: 于8~10 wk龄的DBA/1J小鼠尾根部皮内注射鸡CoⅡ进行被动免疫, 建立小鼠CIA模型, 以CIA发生率、关节炎指数及关节组织的病理变化为指标,评价抗VEGF抗体对CIA形成的影响.结果:与对照组相比较, 在CIA形成的早期, 注射抗VEGF中和抗体能有效地抑制关节炎的产生及减轻其严重程度(P <0.05); 而在CIA已形成后再注射抗VEGF中和抗体对关节炎的严重程度则无明显影响( P >0.05).结论: 抗VEGF中和抗体明显抑制滑膜细胞增殖、血管新生及血管炎, 因此有望成为类风湿性关节炎(RA)治疗的新型制剂.
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大鼠马兜铃酸肾病模型中炎性细胞浸润的特点及意义
现已证明, 马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephropathy, AAN)与马兜铃酸和马兜铃酸内酰胺有关 [1].共计254种含有马兜铃酸的中药成方[2],非成方的中药组方无法统计, 虽然马兜铃酸具有利尿、祛痰、扩张支气管、强心、降压、抗心律失常、抗过敏、抗炎、解热镇痛、增强免疫功能及抗癌等药理作用, 但其可以引起肾脏损害.
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非小细胞性肺癌局部免疫微环境中细胞因子mRNA表达的分析
目的: 以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)为对象, 探讨肿瘤局部微环境中免疫反应的特点及其对抗肿瘤免疫的影响.方法: 以5例结核性胸膜炎患者作为对照,采用地高辛末端标记的寡核苷酸探针, 以原位杂交技术检测了23例非小细胞性肺癌(NSCLC)患者的新鲜胸腔积液和/或手术切除标本中的淋巴细胞和肿瘤细胞中,IL-2、INF-γ、IL-12(p40)、IL-18、IL-4、IL-10、TGF-β1、IL-1、IL-3、IL-8、GM-CSF、TNF-α及TGF-α Mrna的表达.结果: NSCLC患者胸腔积液的单个核细胞及肿瘤组织中, IL-4、IL-10、TGF-α和TGF-β1 mRNA的表达水平, 明显高于IL-2、IL-12、IL-18和INF-γ mRNA 的表达; 而结核性胸腔积液的单个核细胞中上述细胞因子mRNA的水平均降低, 并且各细胞因子mRNA的表达水平之间没有明显的差异.结论: NSCLC患者胸腔积液的单个核细胞及肿瘤组织中, II型细胞因子和免疫抑制细胞因子mRNA的表达占主导地位, 反映了肿瘤局部的免疫微环境处于抑制状态.上述结果有助于了解肿瘤逃逸的机制,并为制定NSCLC免疫治疗的方案提供了重要的实验依据.
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微柱凝胶法检测疾病对ABO血型抗原的影响及血清学特性分析
目的: 探讨疾病对ABO血型抗原性的影响及其血清学特性分析.方法: 应用微柱凝胶法、单克隆抗体血型分型试剂和RBC试剂,对100例患者和30例献血员的RBC(检测抗原)和血清(检测抗体)进行正反定型,测定血型抗原性和抗体效价.对血型抗原性极度减弱导致血型鉴定困难的患者血液, 进行吸收放散、血型物质测定、不规则抗体筛选和抗球蛋白试验.结果: 100例患者中血型抗原性减弱者占24%, 其中白血病患者占40%(12/30), 恶性肿瘤患者占36.67% (11/30), 其他疾病患者占2.50%(1/40).抗原性减弱在ABO血型中的分布: A型为40.48(17/42), B型为16.67% (5/30), O型为7.14%(2/28); 献血员血型抗原性减弱者为3.33%(1/30).100例患者中血清血型抗体效价降低者2%, 献血员血清血型抗体效价降低者为0%.结论: 白血病和恶性肿瘤对血型抗原性的影响较其他疾病大,患者ABO血型抗原性减弱正定型时容易导致血型误判, 但其血清中仍存在着规则的抗A或抗B抗体, 唾液中含有血型物质, 应用微柱凝胶法进行正反定型, 同时进行吸收放散试验和血型物质的测定, 能提高血型检测的准确性.
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广东地区汉族人MBL基因点突变的研究
目的: 研究我国汉族人群甘露聚糖结合凝集素(MBL)结构基因外显子1第52、54、57位密码点突变(CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA).方法: 收集广东地区汉族普通人群的血标本,提取白细胞基因组DNA, 以PCR扩增目的基因片段,应用荧光探针杂交可视技术检测其MBL基因的点突变.结果: 从202份样本中,检出GGC54GAC点突变纯合子6例和杂合子44例(等位基因频率为0.139), GGA57GAA点突变杂合子1例(频率为0.002),未发现CGT52TGT点突变(频率为0).结论: 广东地区汉族人群MBL基因点突变的频率较高,为防治MBL缺损病提供了一定的实验依据.
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外周血中造血干细胞数的检测在诊断早期急性移植排斥反应中的意义
目的: 研究器官移植接受者外周造血干细胞数的变化及其意义.方法: 采用SE-9000型全自动血液分析仪分别检测了24例急性器官移植排斥反应接受者、39例器官移植非排斥反应接受者及40例正常人外周血中造血干细胞的数量.结果: 急性器官移植排斥反应接受者外周血中造血干细胞的数量为(1.252±0.162)×109/L,检出率为100%; 器官移植非排斥反应接受者为(0.012±0.011)×109/L,检出率为7.69%; 正常人为未检出.与正常人及器官移植非排斥反应接受者相比较,急性器官移植排斥反应接受者外周血中造血干细胞的数量明显增高(P<0.01).结论: 检测外周血中造血干细胞的数量可作为急性器官移植排斥反应早期筛选和辅助诊断的指标.
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心脏移植后PBMC表面蛋白分子的表达与组织病理学改变的比较
目的: 比较心脏移植前后,外周血单个核细胞(PBMC)表面蛋白分子的表达与组织病理学改变时相间的差别,探讨免疫分子的活性变化与移植器官排斥反应时间进程间的关系.方法: 6例心脏移植患者于术前、术后不同时间点取外周血,用不同荧光单克隆抗体(mAb)标记PBMC表面的蛋白分子后,用流式细胞仪检测MHC-II、CD3、CD4、CD8、HLA-DR和ICAM-I的表达.常规移植术后供心组织病理检查, 根据国际器官移植排斥反应的病理诊断标准分级.结果: (1)6例实施心脏移植的患者中, 有3例在不同时间发生不同程度的急性排斥反应.(2)发生排斥反应的病例在整个30 d的观测期内, CD3、CD4及CD8的表达水平, 均高于未发生排斥反应的病例.(3)发生移植排斥反应的患者,其PBMC上HLA-DR的表达于移植术后72 h出现高峰, 出现高峰的时间较用活组织检查诊断排斥反应的时间早4~7 d.(4)发生排斥反应的患者PBMC上MHC-II及ICAM-I的表达,分别于术后3 d及2 d 出现高于术前的表达峰,于术后15 d达峰值,峰值的出现时间与病理改变基本同步.结论: (1)心脏移植患者术前的免疫功能状况,与移植术后排斥反应的发生率及严重性有一定的相关性.(2)监测PBMC表面HLA-DR、MHC-II及ICAM-I分子的表达, 对临床早期发现心脏移植排斥反应具有一定的指导意义.
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肝癌相关抗原HAb18G的高效原核表达及其体外功能的研究
目的: 构建HAb18G的原核表达载体, 并在大肠杆菌中诱导高效表达, 进行功能、免疫原性测定.方法: 采用PCR技术, 从已构建的pBluescript/HAb18G克隆载体中扩增HAb18G全长cDNA, 克隆入原核表达载体pRSET-C,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达, 表达产物用SDS-PAGE检测, 表达量用激光薄层扫描检测.纯化表达的HAb18G蛋白, 并用明胶酶谱和ELISA法进行测定.结果: 双酶切及DNA测序证实, 载体构建正确.SDS-PAGE鉴定表明, 表达产物的相对分子质量(Mr)为34 600,与理论值相符.激光薄层扫描检测, 表达量占菌体总蛋白量的33%.明胶酶谱结果呈阴性,但ELISA测定结果呈阳性.结论: 实现了HAb18G的原核高效表达.初步证明,该蛋白具有免疫原性但无刺激产生基质金属蛋白酶的功能,为HAb18G蛋白的大量制备及深入研究奠定了基础.
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昆虫抗冻蛋白DAFP的原核表达、纯化和抗血清制备
目的: 制备昆虫抗冻蛋白DAFP特异性的鼠抗血清.方法: 根据GenBank已发表的Dendroides canadensis抗冻蛋白基因序列(gi: 2737939),人工合成加拿大拟步甲虫(Dendroides canadensis)的抗冻蛋白基因(dafp),并克隆到原核表达载体pGEX- 4T-1和pMAL-p2x中,在大肠杆菌中进行表达.表达的融合蛋白经Glutathione Sepharose 4B纯化后,免疫小鼠制备抗DAFP的抗血清,抗体的效价及特异性分别采用ELISA和Western blot 进行检测.结果: SDS-PAGE检测表明,人工合成的dafp基因在大肠杆菌中可表达相对分子质量(Mr)为38 000的可溶性融合蛋白.以该融合蛋白免疫小鼠所制备的抗体,其ELISA滴度为1∶ 5 000, Western blot证实BL21/pGEX- 4T-1-dafp菌和TB1/pMAL-p2x-dafp菌的表达产物可特异性地与该抗体结合.结论: 在大肠杆菌中成功地表达了DAFP的融合蛋白并制备出抗融合蛋白的鼠抗血清,为进一步研究DAFP的特性奠定了基础.
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SARS病毒N蛋白的表达与DNA疫苗的构建
目的: 在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒核衣壳N蛋白, 并构建其DNA疫苗.方法: 构建含N基因的原核表达载体pQEN, 并在大肠杆菌M15中表达N蛋白.采用Ni2+亲和层析法纯化目的蛋白.将N基因克隆入真核表达载体pSecTagB中, 构建真核重组质粒pSecN.以其免疫小鼠制备抗血清, 并用ELISA法检测其与大肠杆菌中表达的重组N蛋白及天然全病毒N蛋白的反应性.结果: 重组N蛋白能与DNA疫苗免疫的小鼠血清以及SARS患者血清发生特异性反应; SARS-CoV病毒颗粒也可与DNA疫苗免疫的小鼠血清发生特异性反应.结论: 重组N蛋白保留了病毒的一些特异性抗原表位, 可作为用ELISA法检测SARS-CoV的抗原.构建的DNA 疫苗可在小鼠体内产生高效价的抗SARS病毒N蛋白的特异性抗体, 从而为该疫苗的开发奠定了基础.
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人源性抗角蛋白单链抗体的构建及表达
目的: 克隆抗角蛋白抗体的可变区(V区)基因, 构建抗角蛋白单链抗体(scFv)表达载体并表达.方法: 根据人源性抗角蛋白Fab段的基因序列设计引物, 用PCR方法克隆抗角蛋白抗体的V区基因, 并重组到scFv的表达载体中, 在大肠杆菌进行表达, 表达产物经体外变性复性后进行SDS-PAGE鉴定.用ELISA检测其特异性结合活性.结果: 成功地克隆抗角蛋白抗体的V区基因, 构建了scFv的表达载体, 并在大肠杆菌中表达.ELISA检测证实, 表达的scFv保留了亲本Fab抗体的特异结合活性.结论: 获得功能性抗角蛋白的scFv,可用于进一步的临床应用研究.
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抗CD30L/CD153单克隆抗体的制备与初步鉴定
CD30L(CD153)是肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)中的一个成员, 属Ⅱ型跨膜蛋白,其胞膜外区与其他TNFSF成员(如TNF-α 、LT-α和CD40L等)有较高同源性,主要表达于活化T细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞,以及某些髓系和淋巴系起源的造血系统的恶性肿瘤细胞.
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抗人宫颈癌单链抗体的基因构建、空间结构和进化分析
目的: 构建抗人宫颈癌单链抗体(scFv)基因CSAs-1,并进行二级结构和三级结构预测、理化性质分析及进化树构建.方法: 采用重叠延伸PCR方法, 以能特异性分泌抗人宫颈癌mAb的杂交瘤细胞株CSA125为原料,构建抗人宫颈癌scFv基因CSAs-1, 进行测序; 并通过Internet对其进行结构预测和进化树构建.结果: 抗人宫颈癌scFv基因CSAs-1有834 bp,对应278个氨基酸的多肽, 等电点预测值7.215,为碱性蛋白质; PHDsec二级结构显示CSAs-1属于α+β蛋白, V H和V L区均有多个蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点; CSAs-1三级结构建模显示V L和V H形成一个疏水的“口袋”, Linker游离于此结构之外.以上结果表明: CSAs-1符合scFv的结构特点,明显具有抗原结合位点的空间构象, 理论上应该具有良好的抗原结合活性.进化分析发现脊椎动物V基因形成三个进化群, CSAs-1 V区分布于进化树的A群中.结论: 构建一个鼠源性抗人宫颈癌scFv基因CSAs-1,为该基因的进一步原核和真核表达打下了基础; 应用信息学技术所获得的预测和分析结果为CSAs-1表达、纯化和活性研究提供了大量的信息; 为进一步分析抗体V H、V L在抗体功能中的作用、改造抗体、实现抗体的人源化、提高抗体的活性等方面提供了一定的依据.
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人源性抗地高辛单链抗体(scFv)及diabody的获取
目的: 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体(scFv),并构建双价抗体(diabody).方法: 以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,4轮后挑取集落,用ELISA法鉴定其特异性,并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序分析.选取活性好的抗体基因进行改造, 构建diabody.结果: 在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象, 获得4株可与Dig特异性结合的人源单链抗体, 经DNA指纹分析及测序分析证明为不同抗体基因, 分泌抗Dig抗体的阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第1亚群,重链基因分别属于第3和第4亚群.选取4号克隆进行基因改造, 构建diabody的表达载体, 获得活性较好的diabody.结论: 利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗Dig的抗体,并改造成应用前景较好的diabody,为临床诊断及治疗洋地黄类药物的中毒提供了具有实用价值的人源抗体.
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抗HIV-1 gp120单克隆抗体的制备及其初步应用
目的: 制备抗HIV-1 gp120单克隆抗体(mAb),并建立一种可用于检测gp120的ELISA法.方法: 采用基因工程抗原HIV-1 gp120免疫BALB/c小鼠, 通过B细胞杂交瘤技术制备抗HIV-1 gp120的mAb.用ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、效价及特异性.用饱和硫酸铵(SAS)纯化mAb,并用HRP标记后建立双mAb夹心ELISA法.结果: 筛选出10株稳定分泌抗HIV-1 gp120 mAb的杂交瘤细胞株,9株为IgG,其中4株的腹水效价为32×10-4~256×10-4.所得mAb与HIV-1 gp41、HIV-1 p24及HIV-2 gp36 Ag均无交叉反应,仅与HIV-1 gp120产生特异性反应.用 mAb 6H9和9H12建立了双夹心ELISA法, 检测gp120抗原的灵敏度是10 μg/L.结论: 获得10株特异性强、效价高的抗HIV-1 gp120的mAb, 并建立了灵敏度良好的双mAb夹心ELISA法.
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可与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体的表达及其特性
目的: 在原核细胞中表达经噬菌体抗体库筛选可与HepG2细胞特异性结合的单链抗体(scFv), 并对其特性进行鉴定.方法: 采用正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2, 从人源噬菌体抗体库中筛选可与HepG2细胞特异结合的scFv.对scFv DNA测序后, 以其阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151,在IPTG诱导下表达scFv并以金属离子螯和层析(IMAC)进行纯化, 用100 g/L SDS-PAGE、Western blot及ELISA分析纯化的scFv.将纯化的scFv与HepG2细胞共孵育后, 观察其对细胞生长的影响.结果: 经筛选获得的2个相对特异性的scFv,分别命名为SLH04及SLH10.经IPTG诱导获得可溶性scFv的表达.Western blot分析证明, 表达产物的相对分子质量(Mr)均为36 000左右, 与理论预期值相符.ELISA检测表明,纯化的scFv能与HepG2细胞特异性结合, 并抑制HepG2细胞的生长.结论: 从人源噬菌体抗体库中, 筛选出能与HepG2细胞特异性结合的scFv, 并在大肠杆菌中表达, 有望用于肝癌生物治疗的实验研究.
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HCC特异性结合的scFv-AP融合蛋白的构建与表达
目的: 构建与肝癌细胞特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白,并诱导表达.方法: 提取从大型人源噬菌体抗体库中筛选的含有与HCC特异性结合的scFv-10基因的质粒,用Sfi I、 Not I分别酶切, 连接至经同样双酶切后的原核分泌型表达载体pDAP2上, 转化和筛选后, 阳性细菌经IPTG诱导表达, 细胞ELISA鉴定融合蛋白活性.结果: 重组质粒经PCR扩增, Eco 91Ⅰ单酶切及Eco 91Ⅰ/Not I双酶切鉴定, 证明scFv-10基因已插入到原核分泌型表达载体pDAP2上.表达产物的定位分析表明融合蛋白主要分泌性表达到周质腔,细胞ELISA证明表达产物有与HCC结合的活性.结论: 成功地构建并表达了与HCC特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白,为其应用奠定了基础.
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抗醛糖还原酶单克隆抗体的制备与特性鉴定
目的: 制备抗醛糖还原酶(AR)的单克隆抗体(mAb),并与本室制备的抗醛糖还原酶相似蛋白(ARL-1) mAb进行比较. 方法: 经RT-PCR获得AR基因, 将基因插入Pgex- 4T-1(His)6C中, 构建重组质粒Pgex- 4T-1(His)6C-AR, 以重组质粒转化E.coli Rosetta诱导表达GST-AR蛋白.以纯化的GST-AR蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb.应用间接ELISA和Western blot方法对mAb进行筛选和鉴定.使用Clustalx和 Antheprot软件, 比较AR与ARL-1的同源性, 表达GST-Dar[80~142氨基酸(aa)], 与ARL-1差异较大; 并分析AR的抗原性, 表达GST-Da1(1~79 aa)、GST-Da2(80~99 aa)、 GST-Da3(111~142 aa)、 GST-Da4(143~316 aa).利用AR全长及截短蛋白, 采用Western blot分析制备的抗AR mAb识别AR抗原的部位.结果: 获得3株稳定分泌抗AR mAb的杂交瘤细胞系ARB3、 AR7B3G4和ARF10.3株抗GST-AR的 mAb均为IgG1(κ型), 腹水mAb效价为1∶ 4×105, 细胞培养上清mAb效价为1∶ 1×104, 3株mAb均可与胎盘组织中的AR蛋白起反应, 而与GST-ARL-1和GST蛋白无交叉反应.它们分别为抗GST-Da1、GST-Da3和GST-Da4蛋白的mAb.结论: 成功地制备了3株特异性抗AR mAb,可分别识别AR的 1~79、111~142、143~316位氨基酸.将它们与抗ARL-1 mAb联合应用,将有助于进一步研究AR与ARL-1蛋白的功能, 并为深入探讨AR、ARL-1与相关疾病的关系及进行大规模的流行病学调查提供了有力的工具.
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抗果蝇ECP蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定
目的: 制备抗果蝇ECP蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法: 用大肠杆菌表达并纯化的GST-ECP融合蛋白, 免疫6~8 wk的雌性BALB/c小鼠, 取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合, 经间接ELISA筛选和克隆化培养制备杂交瘤细胞系.用间接ELISA及Western blot等方法对mAb的Ig亚类(型)、腹水效价及特异性进行鉴定.结果: 获得1株杂交瘤细胞株, 命名为8G9.Ig亚类(型)鉴定表明, 此株mAb为IgG1(κ型).腹水mAb的效价为 1∶ 1×105.Western blot分析表明, 该株mAb可与果蝇的幼虫、蛹及成虫组织中表达的ECP特异性结合, 可特异性的识别ECP抗原的231~300aa区段.结论: 获得1株能稳定分泌抗ECP mAb的细胞株, 为进一步研究ECP的功能奠定了基础.
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Jagged1(CD339)诱导调节性T细胞分化、成熟及介导免疫耐受
Jagged1(新近被命名为CD339 [1])是存在于哺乳动物细胞膜上Notch受体的主要配体之一, 为单次跨膜糖蛋白, 表达于骨髓、胎儿肝基质细胞和胸腺上皮细胞等多种组织, 参与调控许多组织的生长发育, 在维持正常造血前体细胞及其增殖过程中起着重要作用 [2].
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内皮祖细胞的研究及进展
内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)是一种起源于骨髓的原始细胞, 类似于胚胎期的成血管细胞(angioblast), 在一定条件下可定向分化为成熟的内皮细胞.在体外, EPC能吸收乙酰化低密度脂蛋白, 结合荆豆凝集素(ulex europeas lectin), 形成毛细血管管腔样结构; 在体内, EPC能募集、归巢到血管损伤区, 分化为内皮细胞, 促进血管再生.
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太空药--"神舟三号"口服液的免疫作用及临床应用
运用空间技术进行微生物诱变育种是培育生物新菌种的一种有效方法, 其原理是通过外层空间特殊的物理化学环境,即微重力、宇宙辐射、高能粒子、交变磁场及超洁净等环境中,引起菌种DNA分子的变异和重组,菌种遗传性状发生改变,从而获得生命力旺盛、生长速度快、代谢产物获得率高、品质优良并可稳定遗传的高产高效菌种.
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细胞因子及其网络调节在口服耐受中的作用
人体每天从食物中摄取大量蛋白, 其中既有能引起超敏反应的异种蛋白抗原, 又有与人体自身蛋白有交叉反应的蛋白抗原.
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骨髓间充质干细胞免疫学特性的研究进展
随着免疫学和移植学的发展, 人类对自身免疫性疾病认识的不断提高和对器官移植的日益接受, 免疫抑制剂在临床医学中的应用愈来愈广泛.
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α5和β1整合素亚基在肺腺癌细胞系凋亡中的作用
整合素作为细胞外基质蛋白(ECM)的受体,参与细胞的生长、增殖及凋亡的调节.当其被ECM激活后, 则可刺激细胞产生生存信号并抑制细胞凋亡.如果整合素与ECM的结合导致细胞内原癌基因的持续激活,肿瘤细胞则可不需要黏附于ECM而生长,因此, 其与肿瘤细胞的侵袭性生长及转移等密切相关 [1].
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双向启动子小干扰RNA载体干扰效率的验证
RNA干扰技术是目前抑制基因功能较为有效的热点技术.通常用于表达小干扰RNA(siRNA)的载体多利用单个RNA聚合酶Ⅲ启动子转录连接在一起的2条互补回文序列, 形成袢状结构的siRNA分子.这种方法需要较长的引物而造价较高,且容易错配, 难于合成和测序; 此外, 袢的长度及序列的差异可以影响siRNA抑制基因表达的效率 [1].
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腹水中外来体的提取及形态特征观察
目的: 从卵巢癌患者的腹水中获得外来体(exosome).方法: 通过低速离心、高速离心、超滤及超高速离心等,从5例卵巢癌患者的腹水中分离外来体,用透射电子显微镜观察其形态特征.结果: 5例卵巢癌患者的腹水中均存在外来体,电镜下观察呈椭圆形或圆形囊泡,直径为30~90 nm, 具有完整的细胞膜.结论: 用离心的方法可从卵巢癌患者的腹水中提取外来体,为卵巢癌的治疗开辟了一种新的途径.
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小鼠OX40稳定表达细胞株的构建及其对B细胞促分化作用的研究
目的: 构建稳定表达小鼠OX40的细胞株HUVEC,并探讨其对B细胞的促增殖作用. 方法: 从ConA活化的小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA, 应用RT-PCR法扩增小鼠OX40的cDNA, 并将其克隆到pUCm-T载体中,经PCR、酶切和测序分析,进而构建pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体.以脂质体法转染HUVEC,经G418筛选后,用流式细胞术检测OX40分子的表达.采用 3H-TdR掺入法,研究OX40信号对体外培养的B细胞的促分化作用.结果: 构建了OX40基因的真核表达载体.经PCR、酶切和测序证实, 插入的目的片段与GenBank登录的小鼠OX40 cDNA序列完全一致.用G418筛选后,获得能稳定表达小鼠OX40蛋白的HUVEC细胞.3H-TdR掺入法结果显示,小鼠OX40稳定表达的细胞HUVEC对体外培养的B细胞具有促增殖、分化的作用.OX40/OX40L信号与CD40/CD40L信号具有协同作用.结论: 成功地构建小鼠OX40稳定表达地细胞,OX40对B细胞具有促增殖、分化作用.
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杂交瘤腹水抗体效价的不稳定性及其对策
自1980年以来, 本实验室陆陆续续共制备了针对200余种抗原的约2 000余株单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞系.
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当归多糖对细胞免疫功能的增进作用
目的: 观察当归多糖(AP)对细胞免疫功能的影响.方法: 用机械分散法制备小鼠单个脾细胞悬液,用MTT比色法检测脾细胞和T细胞的增殖.以免疫磁珠法从小鼠脾细胞中分离纯化T细胞后, 用流式细胞术观察AP对CD4+ T细胞比率的影响.结果: 当归总多糖AP-0及其3个组分AP-1、AP-2和AP-3在30~100 mg/L剂量的范围内,能显著促进脾细胞的增殖(P<0.01); 其中组分AP-3能显著促进混合淋巴细胞和T细胞的增殖反应, 显著增加培养的脾细胞中CD4+ T细胞亚群的比率.结论: AP对细胞免疫功能具有增强作用, T细胞是当归多糖的靶细胞之一.
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哺乳动物shRNA表达载体的构建及鉴定
目的: 构建带有绿色荧光蛋白报告基因的哺乳动物shRNA表达载体.方法: 用PCR方法从含有人U6启动子的载体PTZU6+1中扩增U6启动子, 将其克隆到pEGFP-C1载体中,通过限制性内切酶、PCR及测序对构建的载体进行鉴定, 以其转染HepG2细胞后, 在倒置荧光显微镜下初步观察绿色荧光蛋白的表达.结果: 经限制性内切酶、PCR及测序证实, 成功地构建哺乳动物shRNA表达载体.以其转染HepG2细胞后可以表达绿色荧光蛋白.结论: 构建了带有绿色荧光蛋白报告基因的哺乳动物shRNA表达载体,为以后运用该载体进行RNAi相关研究奠定了一定的基础.
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IL-2对培养的人垂体腺瘤细胞增殖的影响及其机制
目的: 研究IL-2对人垂体腺瘤细胞的增殖、细胞周期、细胞内蛋白激酶C(PKC)及cAMP/cGMP的影响, 并探讨其作用的机制.方法: 采用MTT比色法和3H-TdR掺入法检测IL-2对人垂体腺瘤细胞增殖和DNA合成的影响; 用流式细胞术检测IL-2对垂体腺瘤细胞细胞周期的影响.用放射免疫测定法检测PKC的活性及cAMP和cGMP的含量.结果: (1) IL-2可促进垂体腺瘤细胞增殖和DNA合成,且呈剂量依赖性.(2) IL-2可显著降低垂体腺瘤细胞G 1期的细胞比率, 而增加S期和G 2期的细胞比率.(3)与空白处理组相比较,使用PKC的激动剂PMA处理培养的人垂体腺瘤细胞,可使胞膜和细胞总PKC升高; 而用IL-2(1×10 5 U/L)处理后, 胞质、胞膜和细胞总PKC的活性均升高.(4) IL-2 (5×10 4、1×10 5 U/L)作用于人垂体腺瘤细胞后, 胞内cAMP浓度显著降低; 而cGMP的浓度没有明显改变.结论: IL-2对垂体腺瘤细胞增殖分化的调控作用是细胞内多信息系统相互整合的结果.
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人白介素- 4对牛血管内皮细胞保护作用的研究
目的: 研究人白介素-4(Hil-4)对经TNF-α活化的牛主动脉内皮细胞(BAEC)的保护作用.方法:用不同浓度的Hil 4与BAEC共孵育2 h后,再与4 μg/L的TNF-α共孵育6 h或18 h.应用细胞-ELISA方法, 检测BAEC表面的E选择素和ICAM-1的表达; 用MTT比色法测定Hil-4对BAEC活性的影响.结果: 在一定浓度内用Hil-4预处理BAEC后, 能明显抑制TNF-α诱导活化BAEC上的E选择素与ICAM-1的表达,并呈现一定的剂量依赖性.用MTT比色法测定BAEC活性的实验表明,各实验组BAEC的活性与对照组无明显差异性.结论: Hil-4能明显抑制TNF-α诱导活化的BAEC表达E选择素与ICAM-1; Hil-4对BAEC的正常功能具有一定的保护作用.
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氯霉素-BSA和氯霉素-OVA偶联物的制备与鉴定
目的: 制备氯霉素(CAP)-牛血清白蛋白(BSA)及氯霉素(CAP)-卵清白蛋白(OVA)的偶联物并进行鉴定.方法: 分别采用混合酸酐法和重氮化法制备CAP-BSA及CAP-OVA的偶联物, 前者是将CAP先与琥珀酸酐反应生成CAP-半琥珀酸酯(CAP-HS), 再进行混合酸酐反应.将反应产物CAP-HS与BSA结合, 合成CAP-HS-BSA偶联物; 后者是将CAP分子中的苯环上的硝基还原为氨基后,进行重氮化处理, 然后分别与BSA和OVA连接, 合成CAP-BSA和CAP-OVA复合物.结果: 紫外图谱分析表明, CAP-BSA、CAP-OVA和CAP-HS-BSA的紫外大吸收峰分别是262 nm、213 nm 和275 nm; 计算得CAP与载体蛋白BSA、OVA及HS的偶联比分别为5∶1、12∶1和22∶1.结论: 成功的制备CAP-BSA及CAP-OVA的偶联物,为免疫动物制备抗CAP的抗体奠定了基础.
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GAP- 43干扰RNA表达载体的构建与鉴定
目的: 构建GAP-43小干扰RNA(SiRNA)的表达载体并在大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12中验证其抑制效果.方法: 利用设计软件根据GAP-43 mRNA序列设计特异性SiRNA插入序列, 体外合成该序列后将其定向克隆入真核表达载体pRNAT H1.1/Neo.以LipofectamineTM 2000试剂转染GAP-43-SiRNA表达载体至PC12细胞中, 以NGF诱导PC12细胞GAP- 43的表达, 以免疫组化方法鉴定GAP-43-SiRNA对GAP-43表达的抑制效果.结果: DNA测序证实合成的并被克隆入真核表达载体pRNAT H1.1/Neo的SiRNA插入序列完全正确,GAP-43-SiRNA表达载体转染PC12细胞后可特异性抑制NGF诱导的PC12细胞的GAP- 43的表达.结论: GAP-43-SiRNA表达载体构建成功, 为后期研究GAP-43在少突胶质细胞前体上表达的意义奠定了基础.
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六君子汤上调小鼠免疫功能的机制
目的: 探讨六君子汤(LD)对小鼠的免疫调节作用.方法: 用一定剂量的LD给正常小鼠和免疫抑制小鼠灌胃 7 d, 用ELISA法测定血清溶血素的水平;采用中性红吞噬试验检测腹腔巨噬细胞的吞噬功能;应用重氮化反应测定NO的水平;采用MTT比色法测定淋巴细胞增殖反应.结果: 中剂量的LD可提高正常小鼠的免疫功能,明显提高免疫抑制小鼠的免疫功能.结论: LD对小鼠的免疫功能具有上调作用.
年 | 期数 |
2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2006 | 01 02 03 04 05 06 |
2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
2004 | 01 02 03 04 05 06 |
2003 | 01 02 03 04 05 06 |
2002 | 01 02 03 04 05 06 |
2001 | 01 02 03 04 05 06 |
2000 | 01 02 03 04 05 06 |
1999 | 01 02 |
1995 | 01 02 03 |
1994 | 01 02 |
1993 | 01 02 03 04 |
1992 | 01 02 03 04 |
1991 | 01 02 03 04 |
1990 | 01 02 |
1989 | 01 02 03 04 |