细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位： 中国免疫学会；第四军医大学
- 主办单位： 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子： 0.81
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1007-8738
- 国内刊号： 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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IFN-γ促进人单核细胞向不典型成熟DC分化
目的: 研究IFN-γ对人单核细胞表型及分化的影响.方法: 采用免疫磁珠法从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)中特异性分选单核细胞, 以细胞因子IFN-γ、 TNF-α、 IFN-α刺激单核细胞后, 观察单核细胞生长特性, 并以流式细胞术检测单核细胞表面CD1a、 CD14、 CD80、 CD83、 CD86、 HLA-DR等分子表达.结果: 细胞因子IFN-γ、 TNF-α、 IFN-α对单核细胞形态、生长及表型转化有不同影响.IFN-γ促进单核细胞黏附聚集形成"细胞小岛结构", 刺激单核细胞形态向梭形及多角形转化; IFN-γ上调单核细胞表达CD80、 CD83、 CD86及HLA-DR分子, 同时下调CD14分子表达.结论: IFN-γ促进单核细胞向不典型的成熟DC方向分化.
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茴香霉素对小鼠同种异基因皮肤移植的影响
目的: 阐明茴香霉素对淋巴细胞反应性的影响以及在皮肤移植中抑制排斥反应的作用.方法: 用MTT法检测茴香霉素刺激下淋巴细胞在单向或双向混合淋巴细胞反应中的反应性.C57BL/6小鼠作为供体, BALB/c小鼠作为受体.手术前3 d分别给3组BALB/c小鼠皮下注射生理盐水、环胞霉素A以及茴香霉素, 手术当天继续注射至术后第7天.环胞霉素A及茴香霉素的注射剂量分别为: 20 mg/kg、 12.5 mg/kg.结果: 在剂量10.0 μg/L时, 茴香霉素能抑制单向或双向混合淋巴细胞反应中淋巴细胞的反应性(P均＜0.01); 茴香霉素组移植皮肤的存活时间明显高于环胞霉素A组以及对照组.结论: 茴香霉素能明显抑制淋巴细胞的反应性; 并且能明显延长受体对皮肤移植物的耐受时间, 可能为移植免疫排斥的治疗提供新的途径.
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CR2-DAF和DAF-CR2靶向补体抑制物的构建、表达与鉴定
目的: 构建针对补体激活物的特异靶向补体抑制物, 并对其进行体外活性鉴定.方法: 将补体受体(CR2)与补体抑制物(促衰变因子, DAF)以融合表达方式(顺反结构)克隆到表达载体PBM中, 然后将重组体转移到CHO细胞中进行蛋白表达, 用SDS-PAGE、 Western blot、流式细胞术(FCM)检测、 SPR检测及补体介导的细胞溶解实验对表达的融合蛋白进行生物学活性鉴定.结果: SDS-PAGE和Western blot结果显示出现预期大小的目标片段.FCM与SPR检测结果显示, 重组蛋白CR2-DAF与DAF-CR2能特异地与C3包被的CHO细胞、 C3dg配基相结合.补体介导的细胞溶解实验结果显示, 靶向补体抑制物比相应的非靶向补体抑制物的抑制效果明显(CR2-DAF的抑制效率高达20倍).结论: 成功构建了CR2-DAF和DAF-CR2靶向补体抑制物, 为下一步进行动物体内补体抑制实验奠定了基础.
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抗原特异性Th17细胞的分化与调节
目的: 探讨影响抗原特异性Th17细胞分化和调节的因素.方法: T细胞受体转基因小鼠(DO11.10)CD4+T细胞, 与同背景正常小鼠的脾细胞混合, 经OVA多肽刺激后, 在不同的Th17极化的培养条件下, 观察Th17细胞及细胞因子的产生. 结果: 单纯OVA抗原刺激主要诱导特异性Th1型反应, 在TGF-β和IL-6存在的条件下, 主要诱导Th17反应; 当加入IL-23之后, 促进了Th17细胞的分化.阻断了IFN-γ和IL-4之后, Th17细胞的百分率明显增加.LPS可以促进Th1型细胞因子的产生, 但对抗原特异性Th17细胞的分化没有明显的促进作用.结论: 抗原特异性Th17细胞是与Th1、 Th2相对独立的细胞亚群, TGF-β、 IL-6和 IL-23可诱导或促进Th17的分化, 而Th1和Th2细胞因子抑制其分化.
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实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节
目的: 建立检测小鼠Toll样受体4(TLR4)mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时定量PCR实验; 观察小鼠骨髓源树突状细胞(DC)发育成熟过程中TLR4 mRNA表达水平的动态变化以及地塞米松(DEX)对DC TLR4 mRNA表达的影响.方法: (1)用细胞因子定向诱导的方法将小鼠骨髓细胞培养为DC; (2)构建pUCm-T/TLR4和pUCm-T/β-actin重组质粒, 建立检测小鼠TLR4 mRNA水平的实时定量PCR实验; (3)用实时定量PCR技术对体外培养4、 6、 8、 10、 12 d的DC TLR4 mRNA表达水平进行动态观察; (4)在DC培养体系中加入DEX, 与常规培养DC TLR4 mRNA表达水平进行比较.结果: (1)从小鼠骨髓细胞中成功诱导培养了DC, 经免疫磁珠纯化后其纯度可达90%以上; (2)建立了能精确分析小鼠TLR4 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时定量PCR实验; (3)在DC培养前期TLR4 mRNA表达水平变化不大, 后期则明显升高; (4)DEX可使DC TLR4 mRNA表达增强.结论: 小鼠骨髓源DC TLR4 mRNA表达水平与其发育成熟阶段密切相关; DEX促进DC TLR4 mRNA表达.
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中国恒河猴(Macaca mulatta)外周血Th17细胞及其在SHIV感染后的变化
目的: 对正常中国恒河猴(Macaca mulatta)及嵌合猿猴/人免疫缺陷病毒(SHIV)感染过的中国恒河猴外周血中CD4+IL-17A+和CD4-IL-17A+T淋巴细胞的分布频率进行初步观察.方法: 用荧光染料标记的单克隆抗体(mAb)对10只中国恒河猴的外周血或PMA+Ionomycin刺激后的PBMC细胞表面的CD3、 CD4、 CD8及细胞内IL-17A进行免疫荧光染色.用FACScalibaur获取染色后的样品, 所得数据用CellQuest进行分析.结果: 在6只正常中国恒河猴个体中均能检测到IL-17A+淋巴细胞, 未经刺激培养的样品中IL-17A+细胞频率很低, 但在短期刺激培养后淋巴细胞中具有约1.4%的淋巴细胞为IL-17A+细胞, 明显多于刺激前的IL-17A+淋巴细胞; 在短期刺激培养后CD3+CD4+淋巴细胞中大约有2.7%的IL-17A+细胞或CD4+Th17细胞.对4只SHIV感染个体中Th17细胞的初步分析未发现它们与正常个体间的统计学差异.结论: 与人类相似, 中国恒河猴的外周血中也存在一定比例的Th17细胞, 为进一步利用恒河猴AIDS动物模型分析HIV/AIDS与Th17细胞的关系提供了基础.
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小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达
目的: 构建小鼠胞内病原体抗性基因1(Ipr1)基因与EGFP基因融合表达载体, 观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法: 从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA, 以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列, 克隆至pEGFP-C1载体中, 筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7, 以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照.采用RT-PCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位.结果: 扩增出小鼠Ipr1基因编码序列, 经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达, Ipr1基因表达产物定位于细胞核内.结论: 成功地调取小鼠Ipr1基因, 构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达.Ipr1编码蛋白定位于细胞核内, 提示其是一种调节蛋白.
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小鼠B7-DC胞外段原核表达载体的构建及表达
目的: 构建小鼠B7-DC胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达.方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(DC)中提取总RNA, 经RT-PCR扩增B7-DC胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中, 构建重组表达质粒pET32a(+)-B7-DCECD.重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因, 经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的B7-DC胞外段蛋白.结论: 成功地构建了小鼠B7-DC胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7-DC的功能奠定实验基础.
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甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究
目的: 构建真核表达重组质粒pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB, 并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性.方法: 重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因, 将扩增得到的融合基因片段M2e-CtB定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1a(+)中, 再转化E.coli JM109.将酶切鉴定、 PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB.用KEGEN TRANS Ⅲ阳离子聚合物将重组质粒pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB转染NIH3T3细胞, 经免疫荧光、 RT-PCR产物序列分析、 Western blot检测其稳定表达产物.结果: 重组质粒pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB含完整的M2e和CtB基因, 与相对应基因的序列同源性分别为100%.重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达, 并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18 000的蛋白条带.结论: 成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB, 初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外, 且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性, 为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础.
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早孕外周血及蜕膜中NK细胞表型及T淋巴细胞亚群的变化
目的: 检测孕妇外周血及蜕膜中T淋巴细胞亚群和NK细胞表型, 探讨它们与母-胎界面免疫耐受的关系.方法: 收集20例早孕同一患者的蜕膜组织及外周血, 密度梯度离心法分离出淋巴细胞, 流式细胞术(FCM)检测两组中NK细胞、 T细胞含量及其表面分子CD16、 NKG2A、 NKG2D表达水平.结果: 蜕膜自然杀伤(dNK)细胞占蜕膜淋巴细胞(57.15±4.0)%, 外周血自然杀伤(pNK)细胞占外周血淋巴细胞(11.46±1.58)%; dNK细胞表面CD16的表达明显低于pNK细胞, 二者分别(10.3±3.9)%与(95.6±2.6)%(P＜0.05); dNK细胞表面NKG2A的表达明显高于pNK细胞, 二者分别为(87.10±4.5) %与(27.5±4.2)% (P＜0.01), dNK细胞NKG2D的表达水平与外周血NK细胞相近, 分别为(88.70±4.1)%与(93.10±3.6)% (P＜0.05); 蜕膜中的CD4+T淋巴细胞的表达低于外周血中CD4+T淋巴细胞, 二者分别为(13.70±1.0)%与(15.85±2.4)% (P＜0.05), 蜕膜中CD8+T淋巴细胞表达明显低于外周血中CD8+T淋巴细胞, 二者分别为(15.23±1.5)%与(18.85±1.73)%(P＜0.01).结论: 妊娠期蜕膜中的NK细胞及T淋巴细胞可能是同维持母-胎界面的免疫耐受的重要原因.
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新型自杀基因linamarase/linamarin系统对人肝癌细胞HepG2体外杀伤效应及其旁观者效应的初步观察
目的: 研究新型自杀基因亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙(lis/lin)统对人肝癌细胞HepG2的体外杀伤效应.方法: 应用分子克隆技术构建热带植物木薯的cDNA文库, 并从中扩增出lin基因克隆至pEGFP-N1载体, 构建质粒pEGFP-N1-lis.通过电穿孔法将其转染人肝癌细胞株HepG2, 同时进行G418筛选, 直至出现抗性克隆, 扩大培养, 命名为HepG2/lis, 通过荧光显微镜观察、 RT-PCR、 Western blot鉴定lis基因的表达; 采用MTT法观察不同浓度lin对已转染的HepG2的杀伤作用及旁观者效应.结果: RT-PCR和Western blot证明转染的lis基因能够在HepG2细胞中表达并产生融合蛋白lis-EGFP; 低浓度lin对转染了lis基因的HepG2细胞具有明显的细胞毒效应; 旁观者效应显示仅10%左右的HepG2/lis细胞与90%的HepG2细胞混合培养于lin浓度为500 mg/L的培养基时, 就可显示出明显的旁观者效应.结论: lis/lin自杀基因系统在lin浓度为500 mg/L时对人原发性肝癌细胞HepG2具有明显的杀伤作用和旁观者效应.
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雷公藤在大鼠1型糖尿病模型中对调节性T细胞Foxp3表达的影响及意义
目的: 研究雷公藤在大鼠1型糖尿病模型中对CD4+CD25+调节性T细胞(Tr)Foxp3基因表达的影响及意义.方法: 将48只大鼠随机分为3组, 每组各16只, Ⅱ、Ⅲ组采用小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法制备大鼠1型糖尿病模型, Ⅰ组为正常对照.Ⅲ组在成模后给与雷公藤多甙(GTT)灌胃, 1次/d, 连续3个月.淋巴细胞转化试验(MTT法)检测脾淋巴细胞增殖活性; 荧光定量PCR检测外周血及脾淋巴细胞Foxp3 mRNA的表达; 免疫组化检测淋巴结和脾组织FOXP3蛋白的表达.结果: Ⅱ、Ⅲ组血糖水平高于Ⅰ组(P＜0.01); 胰岛中Ⅲ组淋巴细胞浸润程度较Ⅱ组减轻; Ⅱ、Ⅲ组淋巴细胞增殖活性均较Ⅰ组升高(P＜0.01), 用药后Ⅲ组较Ⅱ组降低; Foxp3 mRNA、 FOXP3蛋白表达水平Ⅱ、Ⅲ组均高于Ⅰ组(P＜0.05), Ⅲ组表达水平较Ⅱ组有所升高, 但差别无统计学意义(P＞0.05).结论: Foxp3+Tr细胞参与了STZ诱导的大鼠1型糖尿病的发生发展; 上调Tr细胞Foxp3基因的表达可能为雷公藤治疗1型糖尿病的机制之一.
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腺病毒介导的肝癌靶向SEA-CD80基因治疗及免疫学机制的初步研究
目的: 观察肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A (SEA)/CD80基因重组腺病毒载体对肝癌的疗效,并对其免疫学机制进行初步研究.方法: 利用AdEasy腺病毒系统分别构建并制备甲胎蛋白(AFP)启动子和增强子Ⅰ调控的SEA和/或CD80基因重组腺病毒载体, 然后采用瘤体内直接注射的方式对小鼠皮下移植性肝癌进行治疗, 采用RT-PCR和Western blot方法检测腺病毒注射部位的SEA和CD80 mRNA和蛋白的表达情况; 采用ELISpot方法和LDH释放实验分别检测脾脏淋巴细胞中肝癌特异性IFN-γ分泌细胞的频数和细胞毒性T细胞(CTLs)对Hepa1-6细胞的特异杀伤活性; 通过观察荷瘤小鼠经治疗后肿瘤体积的变化及生存时间, 评价重组腺病毒对肝癌的治疗作用.结果: 我们构建的腺病毒能够使SEA和/或CD80 mRNA和蛋白靶向地在肝癌组织中表达; 与空载体组和PBS对照组相比, 双基因组和单基因组分泌IFN-γ的T细胞数量均明显增多, CTL对Hepa1-6细胞的特异性杀伤作用均明显增强, 荷瘤小鼠肿瘤体积明显减小, 生存期明显延长; 双基因组的疗效和对免疫系统的激活作用明显高于单基因组; CD80 和SEA的组之间、空载体和PBS组之间无明显差异.结论: 我们制备的肝癌靶向性重组腺病毒对肝癌有良好的治疗作用, 联合基因治疗优于单个基因治疗.
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哮喘灵雾化吸入对哮喘大鼠IFN-γ、 IL-4及IgE水平的影响
目的: 探讨哮喘灵雾化吸入对哮喘鼠血清中IFN-γ、 IL-4 和IgE水平的影响及其可能机制.方法: 建立Wistar大鼠哮喘模型, 哮喘灵(27.84 g/kg、 13.92 g/kg)雾化吸入治疗7 d, 用放射免疫法测定血清中IFN-γ、 IL-4及IgE的含量.结果: 与模型组比较, 哮喘灵治疗组大鼠血清IFN-γ水平升高(P＜0.05)、 IL-4和IgE水平下降(P＜0.01), 且药物治疗组大鼠的哮喘症状得到缓解, 引喘潜伏期明显延长.结论: 哮喘灵可通过调节哮喘鼠IFN-γ、 IL-4和IgE的水平而起到治疗哮喘的作用.
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细胞毒T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与乳腺癌易感性的关联研究
目的: 探讨CTLA-4基因多态性位点-1722T/C和CT60G/A与中国北方汉族妇女乳腺癌易感性的关系.方法: 采用聚合酶链反应(PCR)和限制性片段长度多态性方法, 对328例中国北方汉族乳腺癌患者和327例正常对照者进行CTLA-4基因-1722位点和CT60位点多态性检测. 结果: 乳腺癌患者CTLA-4基因CT60位点G等位基因频率在乳腺癌患者组中明显高于正常对照组(28.7% 比23.5%; P=0.0352, OR=1.30, 95% CI=1.02～1.67); -1722C-CT60A单体型在对照组中的频率大于病例组中的频率, 有明显差异(P=0.0283, OR=0.77, 95% CI=0.97～0.61), 而在-1722位点基因型频率、等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论: CTLA-4基因多态性-1722和CT60两个位点与我国北方汉族妇女乳腺癌发病存在一定的相关性.
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Lewis y抗体对α1,2岩藻糖转移酶基因转染后卵巢癌细胞的体外抑制作用
目的: 探讨Lewis y单克隆抗体(mAb)对α1,2岩藻糖转移酶基因转染后高表达Lewis y抗原的卵巢癌细胞系RMG-I-H的体外增殖能力、黏附力以及侵袭力的抑制作用. 方法: 通过体外细胞增殖实验、细胞黏附实验、细胞体外侵袭实验, 以羊抗人IgG抗体处理组或无抗体处理组为对照, 检测Lewis y mAb处理前后RMG-I-H细胞增殖能力、黏附力及侵袭力的变化.结果: 细胞增殖力与黏附力测定结果表明, 实验组与对照组之间有统计学意义(P＜0.05), 且与对照组相比, 第2～7天的生长抑制率分别为5.62%、 19.75%、 34.96%、 46.51%、 49.78%和33.33%.不同培养时间(15、 30、 60 min)的黏附抑制率分别为47.59%、 58.64%和13.85%.体外细胞侵袭实验显示不同浓度Lewis y抗体处理组与对照组比较均无统计学意义(P＞0.05).结论: 抗Lewis y mAb能明显抑制体外RMG-I-H细胞的生长及增殖能力、降低体外培养的RMG-I-H细胞的黏附性, Lewis y抗原与卵巢癌细胞增殖、黏附的生物学行为有关, Lewis y抗体在肿瘤的治疗中显示出潜在的应用价值.
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肿瘤坏死因子β基因多态性与西方型、亚洲型多发性硬化的相关性
目的: 研究肿瘤坏死因子β(TNFβ)基因多态性与西方型、亚洲型多发性硬化(MS)的相关性.方法: 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对22例西方型MS患者、 36例亚洲型MS患者和79名健康人进行TNFβ基因多态性分析.对两型MS组患者分别进行神经功能缺损程度的扩展病残状态(EDSS)评分、首发年龄、病程、发病次数等临床资料收集.结果: ①亚洲型MS组TNFβ1等位基因频率为51.39%, 较健康人(27.85%)明显升高(P＜0.01).②西方型MS组与亚洲型MS组基因型为TNFβ1/1、 TNFβ1/2、 TNFβ2/2 的EDSS评分组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05).③两亚型在EDSS评分、首发年龄、性别、病程、发病次数诸方面均无统计学意义.结论: TNFβ1等位基因与亚洲型MS的易患性有关.TNFβ基因多态性与EDSS评分无明显相关性.
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人ERβ AF1融合蛋白的表达及其多克隆抗体制备
目的: 制备雌激素受体β多克隆抗体.方法: 从人乳腺cDNA文库中PCR扩增ERβ AF1结构域(1～144位氨基酸), DNA 重组插入原核表达质粒pGEX-KG, 转化大肠杆菌DH5α, 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-ERβ AF1融合蛋白.纯化后免疫BALB/c小鼠, 制备鼠多抗血清.通过Western blot和免疫组织化学实验鉴定血清特异性和效价.结果: 成功构建了pGEX-KG/ERβ AF1原核表达载体, 转化DH5α后可高效表达融合蛋白GST-ERβ AF1, 免疫产生的ERβ多抗可特异检测ERβ真核表达载体转染人293T细胞及乳腺癌细胞中ERβ的表达.结论: 制备的ER 抗体对ERβ有反应原性, 效价高, 特异性好, 为进一步研究ERβ的生物学功能奠定基础.
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重组鸡Igλ轻链真核细胞分泌表达及其单克隆抗体的制备与鉴定
目的: 构建重组载体pcDNA-λ并在COS7细胞分泌表达鸡Igλ轻链, 制备抗鸡Igλ轻链的单克隆抗体(mAb).方法: PCR扩增带有信号肽的鸡Igλ轻链基因, 限制性酶切消化后, 定向克隆于真核表达载体pcDNA3, 构建具有6×His标签、分泌表达的重组载体pcDNA-λ.重组载体转染COS7细胞后, SDS-PAGE分析真核表达载体pcDNA-λ在COS7细胞的分泌表达.用2×106个雏鸡B淋巴细胞免疫BALB/c小鼠, 取脾细胞与骨髓瘤细胞融合, 分别采用细胞免疫荧光和间接ELISA筛选阳性杂交瘤克隆.结果: 成功构建分泌表达鸡Igλ轻链的重组载体, SDS-PAGE分析表明在COS7细胞上清有目的蛋白的分泌表达.杂交瘤细胞经筛选与鉴定, 获得2株分泌抗鸡Igλ轻链mAb的杂交瘤细胞株, Western blot检测到该mAb对重组鸡Igλ轻链的反应性.结论: 构建了重组表达载体pcDNA-λ并在COS7细胞上清分泌表达了重组鸡Igλ轻链.并用淋巴细胞杂交瘤技术成功筛选出抗鸡Igλ轻链mAb.为深入研究鸡Igλ轻链的结构与功能奠定了基础.
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人F1F0-ATP合成酶β亚基的原核表达、纯化及抗体制备
目的: 原核表达、纯化人F1F0-ATP合成酶β亚基(hATP5B)并制备其多克隆抗体.方法: 以人脐带静脉内皮细胞 (HUVEC) 总RNA为模板, 通过RT-PCR扩增hATP5B 成熟肽编码序列, 克隆入原核表达载体pET28a(+), 转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)并诱导表达, 表达产物用Ni2+螯合层析纯化, 纯化产物用透析复性, 产物用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.复性产物免疫家兔, 制备多克隆抗体; 多抗的效价用间接ELISA法检测, 并用Western blot和细胞免疫荧光分析多抗的特异性和抗原结合性.结果: 测序证实获得hATP5B成熟肽编码序列.SDS-PAGE鉴定表明, 表达、纯化、复性产物的相对分子质量(Mr)均约55 000, 与理论值相符.灰度扫描分析重组hATP5B(recombinant hATP5B, rhATP5B)的表达量占菌体蛋白总量的36.8%, 纯化产物纯度达98.3%, 复性产物纯度达99.2%.Western blot反应阳性.多抗的平均抗体效价为1∶640 000, 可特异识别HUVEC中的天然抗原.结论: 原核表达的hATP5B具有良好的免疫原性, 其免疫家兔后获得的多抗具有高效价和特异性.hATP5B的原核高效表达和其抗体制备为进一步研究hATP5B的功能奠定了实验基础.
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兔抗人CD1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定
目的: 制备兔抗人CD1d分子α3结构域(hCD1d-α3)多克隆抗体.方法: PCR法扩增出人hCD1d-α3编码区基因, 将其克隆入原核表达载体pET28中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 用IPTG诱导重组蛋白的表达, 用Ni2+-NTA Agarose亲和层析法纯化重组蛋白, 以之为免疫原免疫家兔, 制备多克隆抗体, 并用ELISA、 Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果: 成功构建了hCD1d-α3原核表达载体pET28/hCD1d-α3, 高效表达并纯化hCD1d-α3蛋白, 间接ELISA检测所制备抗体的效价为1∶6 400, Western blot显示该抗体能与hCD1d特异结合, 免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人小肠组织中的天然hCD1d.结论: 通过制备重组hCD1d-α3蛋白为免疫原, 免疫家兔, 成功地制备了效价高、特异性好的抗hCD1d-α3多克隆抗体.
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抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的: 研制抗李斯特菌溶血素(LLO)的单克隆抗体(mAb).方法: 通过诱导重组大肠杆菌BL21(pGEX-6p-1-hly), 以SDS-PAGE分离菌体蛋白, 切割目的蛋白LLO-GST条带, 研磨粉碎后免疫BALB/c小鼠, 取免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合.利用亲和层析法纯化目的蛋白, 作为检测抗原进行杂交瘤细胞的筛选.采用间接ELISA法测定腹水效价, Dot-ELISA、 Western blot分析mAb的特异性.结果: 获得3株稳定分泌抗LLO mAb的杂交瘤细胞株3B6、 4D1、 5D10, 其Ig亚类均为IgG1.3B6、 4D1、 5D10腹水的ELISA效价分别为1:2×105、 1:2×105、 1∶1×105.Western blot试验中, 3株mAb均能与融合蛋白LLO-GST发生反应出现特异性条带, 而与纯化蛋白GST不反应.在Dot-ELISA试验中, 3株mAb均能与表达LLO的细菌发生特异性反应.结果表明, mAb 3B6、 4D1、 5D10是针对LLO的特异性mAb.结论: 成功地制备了抗LLO的mAb, 为进一步研究LLO的生物学特性、产单核细胞李斯特菌的致病机制, 以及建立产单核细胞李斯特菌(LM)快速检测技术奠定了基础.
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全人源抗肝癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定
目的: 构建人源抗肝癌噬菌体单链抗体库, 从中筛选抗肝癌单链抗体(scFv), 并对其特异性进行鉴定.方法: 采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库.对初级抗体库进行亲和富集及ELISA筛选, 获得的阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序.结果: scFv基因与载体连接后得到库容量为1.0×108的初级噬菌体抗体库.对抗体库进行3轮正负淘选和富集后, 随机挑取2 798个克隆进行ELISA, 发现3个克隆对HepG2呈强阳性反应, 而与QSG-7701等人正常细胞系呈弱阳性或不反应.对克隆SA3进行免疫细胞化学鉴定, 结果与ELISA一致.免疫组织化学鉴定表明SA3与肝癌组织和肝组织阳性率的差别有统计学意义.结论: 构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌噬菌体抗体库.通过淘选富集、 ELISA和免疫组织化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆, 为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础.
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抗人ILT-4单克隆抗体制备及初步鉴定
目的: 制备抗人ILT4分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法: 应用淋巴细胞杂交瘤技术, 制备小鼠源性抗人ILT4 mAb.用间接ELISA法测定腹水mAb的效价.以Western blot测定mAb的抗原结合活性.通过流式细胞术(FCM)对mAb结合转染细胞表面及天然细胞表面ILT4分子的活性进行鉴定.结果: 获得7株分泌抗ILT4 mAb的杂交瘤细胞株.ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10-6, 7株mAb均为IgG1(κ).Western blot结果显示, 3株mAb与人ILT4有良好的结合活性.用转染细胞及U937细胞做FCM分析发现另外4株mAb可结合真核表达的及天然的ILT4分子.结论: 获得7株能特异性识别ILT4分子的mAb, 为研究ILT4分子的组织分布和功能研究提供了可靠的实验手段.
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人GITRaa27-165蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备
目的: 表达和纯化人GITR胞外段(hGITRaa27-165)融合蛋白, 制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb).方法: 利用PCR从pGEM T-hGITR获得hGITRaa27-165编码序列, 将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建重组表达质粒pQE30-hGITRaa27-165; 将阳性重组质粒转化大肠杆菌, IPTG诱导表达融合蛋白, 通过Profinity IMAC Ni-Charged Resin亲和层析柱进行纯化; 纯化蛋白免疫新西兰大白兔, 获取多克隆抗血清并利用Protein A Sepharose柱进行纯化, ELISA法检测抗体效价, Western blot法检测抗体特异性.结果: 构建了pQE30-hGITRaa27-165原核表达载体, 原核蛋白hGITRaa27-165蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达, 通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的hGITRaa27-165蛋白, 蛋白浓度为400 mg/L, 制备的抗hGITRaa27-165多抗效价高达1:1.6×105, Western blot鉴定其具有良好的特异性.结论: 获得高纯度hGITRaa27-165蛋白, 并制备特异性pAb, 将为进一步研究hGITR的生物学功能提供实验基础.
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自身免疫性糖尿病研究进展
Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)和成人隐匿性自身免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes of adults, LADA)都属于自身免疫性糖尿病.
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小分子肽制备抗体方法的研究进展
许多生理调节所必须的因子都是很小的肽类, 生物技术的发展也促进了大量小分子基因工程肽类药物的出现, 因而小分子肽的分离、纯化与鉴定技术日趋重要.小分子肽的界限划分迄今未有明确定义, 一般认为小分子肽的相对分子质量(Mr)均在3000以下[1].在小分子肽的生物学功能、鉴定与其相互作用的蛋白质的研究中, 特异性抗体是一重要的研究工具[2].鉴于小分子肽仅有反应原性, 免疫原性较弱,因此在小分子肽制备抗血清过程中采取多种方法.
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白细胞介素-21对免疫细胞的调节作用
IL-21在发挥生物学活性过程中与IL-2、IL-4、IL-9和IL-15等细胞因子受体共用γ链,均属于γc(共同γ链)依赖性细胞因子家族成员.
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149位丝氨酸在CDC25B诱导小鼠卵母细胞减数分裂中的功能
目的: 研究小鼠卵母细胞减数分裂过程中, 149位丝氨酸对CDC25B磷酸酶功能的影响.方法: 将野生型CDC25B-WT和突变型CDC25B-S149A体外转录成mRNA, 显微注射到小鼠GV期卵母细胞中, 观察减数分裂恢复情况, 同时检测了各组卵母细胞CDC2-Tyr15的磷酸化状态.结果: 在小鼠卵母细胞减数分裂过程中, 野生型CDC25B能促进减数分裂的重启动, 活化有丝分裂促进因子, 其突变体CDC25B-S149A对减数分裂的诱导作用丧失, 不能活化有丝分裂促进因子.结论: 149位丝氨酸的完整是CDC25B磷酸酶发挥调节功能所必需的.
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血小板、红细胞对T细胞亚群的调控作用
目的: 在体外实验中, 探讨血小板和红细胞对T细胞亚群的调控作用. 方法: 流式细胞术测定血小板CD59、红细胞CD59、 T细胞CD3+CD4+、 CD3+CD8+的表达水平.按不同的实验条件进行分组, 全血细胞组、有PL无红细胞(RBC)组、无血小板(PL)组、无RBC无PL组.同时观测各组抗原刺激前后T细胞变化.结果: 各组T细胞CD3+CD4+、 CD3+CD4+/CD3+比较: 全血细胞组＞有PL无RBC组, 抗原刺激前后(P＜0.001); 有PL无RBC组＞无RBC无PL组刺激前(P＞0.05)刺激后(P＜0.05).各组T细胞CD3+CD8+表达无明显变化.各组CD3+CD8+/CD3+比较: 全血细胞组＜有PL无RBC组抗原刺激前后(P＜0.01); 有PL无RBC组＜无RBC无PL组刺激前(P＞0.05)刺激后(P＜0.05).全血细胞组和无PL组比较各项指标均无统计学意义(P＞0.05).抗原刺激前RBCCD59与CD3+CD4+在全血细胞组中负相关(P＜0.05); 而在无PL组中则无相关性; PLCD59与CD3+CD8+CD3+全血细胞组中的正相关无统计学意义(P＞0.05); 而在无红细胞组中则呈负相关(P＜0.05).结论: 活化血小板、红细胞均可正向调节CD3+CD4+/CD3+, 负向调节CD3+CD8+/CD3+.
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抗人乙酰胆碱受体单链抗体1956#在大肠杆菌中的可溶性表达
目的: 重组表达抗人乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体(scFv)1956#, 提高scFv1956#的可溶性表达量.方法: 用PCR扩增含抗人AChR scFv1956#的载体pHEN1中的scFv1956#结构基因, 并将其插入到原核表达载体pET44a(+).用重新构建的载体转化E.coli BL21(DE3)pLysS, IPTG诱导表达.用SDS-PAGE来比较更换载体及不同温度和时间对可溶性表达量的影响, 并通过Western blot进行鉴定.结果: PCR产物大小为785 bp, 与预计相符; 所构建质粒经测序证实scFv1956# 核苷酸序列正确, 并正确插入载体pET44a(+).诱导后得到的可溶性表达量优于原载体pHEN1.结论: 载体pET44a(+)表达的端融蛋白NusA可以帮助scFv1956# 的正确折叠, 从而获得大量可溶性表达.低温长时间诱导有助于提高可溶性表达的量.
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Wee1-GFP在CTL介导的细胞毒效应中的作用研究
目的: 研究Wee1-GFP融合蛋白对胞毒T细胞介导的胞毒效应的影响.方法: 采用脂质体将融合基因Wee1-GFP导入鼠胰岛瘤细胞(NIT-1)并检测其表达.以转染pWee1-GFP和空载体的NIT-1为靶细胞, 采用ELISA凋亡试剂盒和乳酸脱氢酶法检测胞毒T细胞介导的细胞毒效应.结果: Western blot检出Wee1-GFP融合蛋白的表达.转染Wee1-GFP的靶细胞发生凋亡及损伤的细胞数比转染空载体的靶细胞少.结论: Wee1-GFP基因转染靶细胞具有一定的抵抗CTL介导的胞毒效应的能力.
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包裹NR2B重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析
目的: 制备包裹pcDNA3.1-NR2B重组质粒的免疫脂质体.方法: 采用逆相蒸发法, 制备含pcDNA3.1-NR2B质粒的脂质体, 并与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体的单克隆抗体(mAb OX26)相连, 形成免疫脂质体, 并对其形态结构、粒径、包封率及偶联抗体的分布进行初步检测研究.结果: 所获得的免疫脂质体近球形、平均粒径低于100 nm、包封率达30.4%、偶联抗体呈均匀分布.结论: 成功地制备了免疫脂质体, 为应用于体内试验奠定了基础.
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MicroRNAs在SLE患者外周血中的异常表达
目的: 通过比较微小RNAs(microRNAs)在系统性红斑狼疮患者和正常健康对照人外周血单个核细胞中的表达情况, 发现在SLE中异常表达的microRNAs.方法: 分离外周血单个核细胞, 其中SLE患者20例, 健康对照组15例.将SLE患者和健康对照组的PMBC分别混合, 提取总RNA, 分离提纯microRNA, 探针标记, 芯片杂交, 扫描后进行数据分析.以两组间信号强度比值＞2或者＜0.5表示两组间microRNAs 表达差异有统计学意义.结果: 两组共筛选出27种有效表达的人源性microRNAs, 其中SLE组和对照组表达无明显差异的有14种, 11种microRNAs在SLE组中高表达, 2种microRNAs在SLE组中低表达.结论: 多种microRNAs在SLE患者外周血单个核细胞中异常表达, 提示它们可能在SLE的发生发展中起着重要的调控作用.
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Triton X-100洗涤剂对抗原包被效率的影响及其对策
目的: 观察抗原中残留的洗涤剂成分在间接ELISA筛选阳性杂交瘤克隆时, 对抗原包被效率的影响以及相应的对策.方法: 以卵白蛋白(OVA)、卵运铁蛋白(OT)和本室制备的相应的单克隆抗体(mAb)作为实验模型, 在抗原中加入不同浓度梯度的Triton X-100包被ELISA板, 用相应的mAb细胞株培养上清做间接ELISA, 确定Triton X-100对包被效率的影响.结果: 当包被抗原中Triton X-100的浓度为3×10-6(v/v)时, 可以明显抑制包被效率, 当Triton X-100的浓度为1.6×10-4(v/v)时几乎可以完全抑制抗原的包被;在含有一定浓度Triton X-100的条件下, 提高抗原的浓度, 或适当增大包被过程中的稀释倍数, 可以明显提高包被效率.结论: 洗涤剂对抗原包被有较强的影响, 在抗体制备过程中, 应尽量提高抗原的初始浓度, 降低洗涤剂的浓度, 设计合理的针对含有洗涤剂抗原的ELISA筛选方案, 是mAb制备成功的关键之一.
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Exosome一种新型的潜在的抗肿瘤疫苗
胞外体是真核细胞释放的, 含有多种细胞膜分子以及相关蛋白的小囊泡.系由细胞内的多泡体(multivesicular bodies, MVBs)膜与细胞膜融合后释放到细胞外环境中囊泡状结构, 被称之为胞外体(exosome, EXO).
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 |
| 1995 | 01 02 03 |
| 1994 | 01 02 |
| 1993 | 01 02 03 04 |
| 1992 | 01 02 03 04 |
| 1991 | 01 02 03 04 |
| 1990 | 01 02 |
| 1989 | 01 02 03 04 |
