一种重组口蹄疫疫苗的原核表达、纯化及其活性检测

目的:利用原核表达系统诱导表达一种可以作为口蹄疫疫苗的重组蛋白J11-G,并对这种蛋白进行纯化以及活性检测.方法:对已经构建的表达载体PET28a-J11-G进行酶切鉴定,将鉴定后的重组载体PET28a-J11-G转化入大肠杆菌BL21,在BL21细菌细胞中诱导表达月的蛋白,用改良的镍亲和层析法纯化目的蛋白,以EIJSA检测纯化所得蛋白的活性.结果:长期冻存的重组载体PET28a-J11-G结构完整,其在大肠杆菌BL21中经1 mmol/L IPTG诱导后表达出相对分子质量(Mr)约为47 000的目的蛋白,经纯化后获得了产率和纯度均很高的重组蛋白J11-G,ELISA检测证明该蛋白活性良好.结论:成功地对重组蛋白J11-G进行了诱导表达,改良法有利于蛋白产率和纯度的提高,纯化蛋白具有较好的免疫活性.重组蛋白J11-G将可能成为一种抗口蹄疫疫苗.

附睾上皮细胞表达功能性的TLR-2和TLR-4

目的:研究附睾上皮细胞中功能性TLR2和,TLR4的表达情况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western blot和免疫荧光方法探索原代培养大鼠附睾上皮细胞中TLR2和,TLR4的表达情况,同时利用ELISA分别以磷壁酸(LTA)和细菌脂多糖(LPS)对附睾上皮细胞进行功能性检测.结果:TLR2和TLR4在mRNA水平、蛋白水平和细胞水平上在附睾上皮细胞均有表达,TLR2和TLR4的配体LTA和LPS均能激活附睾上皮细胞的天然免疫反应,产生炎症因子TNF-α和IL-1β,差异有统计学意义.结论:附睾上皮细胞表达功能性的TLR2和,TLR4.

Jagged-1对骨髓来源树突状细胞生成细胞因子的影响

目的:探讨可溶性Jagged-1/Fe嵌合蛋白(Jagged-1)对重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白细胞介素4(rmIL-4)体外诱导小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)产生细胞凶子的影响.方法:建立rmCM-CSF和rmIL-4体外诱导DC的模型,观察Jagged-1/Fc对DC分化的形态学影响.通过Luminex蛋白液相芯片技术和ELlSA检测其细胞因子的表达水平,藉MTT法测定可溶性Jagged-1/Fc诱导的DC对同种异基因淋巴细胞增殖的刺激能力.结果:除了TGF-β,Jag-ged-1/Fc诱导的DC与细菌脂多糖(LPS)或酵母聚糖A诱导的DC不同,表现为生成TNF-α的水平明显降低,IL-4显著增高,而IL-10、IL-6、IL-2、IL-12和IFN-γ的水平与对照组无明显差异.γ分泌酶抑制剂DAFT能逆转Jagged-1/Fc抑制DC生成TNF-α.混合淋巴细胞反应显示Jagged-1/Fc诱导的DC对T细胞增殖的刺激能力弱,LPS诱导的DC的刺激能力强.结论:Jagged-1/Fc诱导的DC倾向介导免疫耐受,指导初始T细胞向Th2细胞偏离.

RNAi RelB DC对CD4+CD25+双阳性T细胞诱导效应的实验研究

目的:探讨核转录因子NF-кB/RelB基凶沉默的树突状细胞(RNAi RelB dendritic cell,RNAi helB DC)诱导异基因CD4+CD25+双阳性T细胞牛成的生物效应.方法:实验分为Control-DC组、LPS-DC组、RNAi RelB DC组和LPS-RNAiRelB DC组,各组DC均与同种异基因T淋巴细胞混合反应后,采用流式细胞术(FCM)分析各组CD4+CD25+双阳性T细胞牛成比例.结果:Control-Dc组DC较LPS-Dc组DC诱导CD4+CD25+双阳性T细胞的增高幅度更显著,两者差异具有统计学意义(P＜0.01).RNAi RelB DC组和LPS-RNAiRelB DC组DC诱导CD4+CD25+双阳性T细胞牛成比例与LPS-DC组相比均存在显著差异(P＜0.01),RNAi RelB DC组DC诱导CD4+CD25+双阳性T细胞牛成能力较Control-DC组强,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:RelB基凶被沉默后DC具有较强的诱导CD4+CD25+双阳性T细胞生成的能力,表现出未成熟DC的特点,这种RNAi RelB DC有望成为一种新型的致耐受DC用于免疫耐受的诱导研究.

人外周血CD8+T细胞Runx3的基因克隆及其原核表达

目的:克隆人Runx3基因全长编码区的cDNA,进行鉴定和测序分析,并利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人Runx3基因全长序列,为从转录水平探讨Runx3基因与免疫相关性疾病以及肿瘤发生发展的关系奠定基础.方法:MACS分离外周CD8+T细胞;采用RT-PCR方法从人外周血CD8+T细胞获得Runx3基因的cDNA,并连接pMD19-T载体导入大肠埃希菌DH5α,选择阳性克隆,应用M13 F/R通用引物进行双向反应测序,以作序列鉴定.利用PCR技术从克隆载体pMD19-T/Runx3获得人Runx3的全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pQE30/Runx3;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌M15,测序鉴定后经IPTG 30%诱导4 h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白并进行Western blot鉴定.结果:扩增获得的Runx3基因CDS区全长1 248 bp,编码415个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致.成功构建了原核表达载体pQE30/Runx3,并在工程菌M15中获得大量表达.结论:获得了人Runx3基因的克隆,并成功原核表达和制备出人Runx3融合蛋白.

一种C型CpG ODN对柯萨奇病毒感染小鼠的作用初探

目的:研究自行设计的C型CpG ODN(D-SL01)对柯萨奇病毒感染的潜在治疗作用.方法:用柯萨奇病毒体外感染人HeLa细胞的体外模型观察CpG ODN刺激的人PBMC培养上清的抗病毒作用;利用柯萨奇病毒感染小鼠模型观察腹腔内给予CpG ODN对小鼠体重及心肌病变的影响.结果:D-SL01刺激的人PBMC培养上清不仅能抵抗VSV感染Veto E6细胞,也能明显抵抗柯萨奇病毒对HeLa细胞的感染,其作用强度与A-型CpG ODN 2216相似.然而,当腹腔内连续给药6 d后,D-SL01使柯萨奇病毒感染小鼠的质量下降及心肌病变程度与对照组小鼠相比加重.结论:研究结果提示:体内应用CpG ODN的机制特别是用于病毒感染性疾病时,应该充分注意给药时机、途径及剂量.

自噬在结核分枝杆菌感染中的作用及相关基因的表达

目的:探讨自噬在结核分枝杆菌(MTB)感染中的作用及相关基因的表达.方法:透射电镜观察在雷帕霉素诱导下自噬体的形成,通过克隆形成单位(CFU)检测自噬形成后对胞内感染的MTB H37Rv菌株的清除作用,以实时定量PCR方法检测自噬相关基因atg5、atS7、atg8、atg12 mRNA表达水平.结果:在宙帕霉素诱导下,RAW264.7细胞可形成自噬体,自噬体产牛后对胞内感染的H37Rv菌株具有一定的清除作用.在MTB感染过程中参与自噬形成的atg5、atg8、atg12 mRNA表达量上调,而atg7表达量无变化.结论:自噬参与抗MTB免疫应答过程,而ats5、atg8、atg12是MTB感染形成自噬体的重要调控分子.

GnRH-Ⅰ类似物对离体大鼠胃壁细胞三磷酸肌醇含量的影响

目的:探讨促性腺激素释放激素(GnRH)-Ⅰ类似物阿拉瑞林对离体大鼠胃壁细胞内三磷酸肌醇(IP3)含量的影响.方法:体外分离大鼠胃壁细胞并给予不同浓度的阿拉瑞林孵育,利用标记的[3H]-IP3,采用放射免疫分析法检测了壁细胞内IP3的含量.结果:当加入终浓度分别为0.001、0.01、0.1、1 μmol/L的阿拉瑞林时,大鼠胃壁细胞内IP3的含量逐渐增加,呈剂量依赖性,当阿拉瑞林为1 μmol/L时,IP3的含量达到高峰;同时随着药物作用时间的延长,IP3的含鼍也会增加,当阿拉瑞林作用5 min时,IP3的含量达到峰值,随后开始下降;磷酸二脂酶(PLC)抑制剂Compound 48/80温育细胞后,再加入阿拉瑞林孵育,可使IP3的含量轻度增加,但与PLC抑制剂组相比,无统计学意义(P0.05);IP3受体阻滞剂heparin温育细胞后,再加入阿拉瑞林孵育,壁细胞内IP3含量略有上升,与只加入Heparln组相比无统计学意义.结论:在体外GnRH-Ⅰ类似物可使大鼠胃壁细胞内IP3的含量明显增加,说明IP3参与了GnRH-Ⅰ类似物对大鼠胃壁细胞功能调控的信号转导过程.

富硒酵母对CCl4肝损伤小鼠免疫功能的影响

目的:研究富硒酵母对CCl4肝损伤小鼠免疫功能的影响.方法:将50只小鼠随机分为空白组、模型组、硒酵母组、维生素E(VE)组和混合绀(混合喂食硒酵母和VE),每组10只.空白组和模型组灌胃蒸馏水,硒酵母组灌胃富硒酵母,VE组灌胃VE,混合组同时灌胃和硒酵母组、VE组等量的酵母和VE,连续30 d.实验结束后一次性给予8 g/LCCl4的香油溶液5 mL/kg,空白组给香油.然后测定小鼠T和B淋巴细胞转化率、NK细胞活性和巨噬细胞的吞噬功能.结果:富硒酵母能够显著提高小鼠T和B淋巴细胞转化率、NK细胞活性和巨噬细胞的吞噬功能,且和VE具有协同作用.结论:富硒酵母能提高CCl4肝损伤小鼠的免疫功能.

自然杀伤细胞对高与低表达ABCG2的人耐药鼻咽癌细胞杀伤作用

目的:探讨自然杀伤(NK)细胞对高与低表达三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)人多药耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞(ABCG2High细胞、ABCG2Low细胞)的杀伤活性差异.方法:利用免疫磁珠技术分离ABCG2High及ABCG2LowCNE2/DDP细胞、NK细胞,LDH释放测定法检测NK细胞对K562细胞、ABCG2High<及ABCG2LowCNE2/DDP细胞的杀伤活性,流式细胞技术(FCM)检测两种靶细胞NKG2D配体表达率及杀伤后靶细胞凋亡率.结果:ABCG2High、AB-CG2Low CNE2/DDP细胞分离后ABCG2表达率分别为(91.40±2.32)%、(1.70 ±0.24)%,分选后NK细胞CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上,LDH释放测定法检测结果显示,在效靶比为10 vs 1、20 vs 1时,NK细胞对ABCG2Low细胞、ABCG2High细胞及K562细胞的杀伤率以ABCG2High曲细胞高,凋亡率检测结果显示ABCG2HighCNE2/DDP细胞的凋亡率为(12.90±1.51)%,ABCG2LowCNE2/DDP细胞的凋亡相率为(6.13±0.85)%,NKG2D配体表达率检测结果显示AB.CG2High CNE2/DDP细胞5种NKG2D配体(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)表达率高于ABCG2LowCNE2/DDP细胞.结论:ABCG2HighCNE2/DDP细胞比ABCG2LowCNE2/DDP细胞更容易被NK细胞杀伤,其初步的机制是ABCG2HighCNE2/DDP细胞NKG2D配体表达率高于ABCG2LowCNE2/DDP细胞,导致了ABCG2HighCNE2/DDP细胞对NK的杀伤敏感性增强.

白细胞介素17在乙肝肝纤维化中的表达及意义

目的:探讨白细胞介素17(IL-17)与慢性乙型肝炎病毒(HBV)相关件肝病特别足乙肝肝纤维化发生的相关性.方法:酶联免疫吸附试验(ELISA)及逆转录一多聚酶链反应(RT-PCR)法分别测定36例慢乙肝、42例肝硬化(Child-pughA、B、C分别为15、12、15例)、34例原发性肝癌、30例慢性重型乙型肝炎及20例健康对照者血清中的IL-17和外周血单个核细胞(PBMC)中IL-17mRNA水平及肝硬化Child-pugh分级患者血清中的IL-17和肝纤维化指标Ⅳ型胶原(C-Ⅳ),层黏连蛋白(LN),透明质酸(HA)的浓度.结果:与正常对照组相比,血清IL-17和PBMC中IL-17mRNA.水平在4组病人中表达升高(P<0.01);与其他各组相比,IL-17及mRNA水平在肝硬化中升高尤其明显(P<0.01).肝硬化患者血清IL-17及肝纤维化指标水平在Child-pugh C组高于Child-pugh A和Child-pugh B组,Child-pugh B组高于Child-push A组(P<0.01).IL-17水平与Child-push分级评分及C-Ⅳ,LN,HA浓度均呈正相关(r=0.582、0.568、0.682、0.764,P<0.01).结论:IL-17在慢性HBV相关性肝病尤其是乙肝肝硬化中表达明显升高,IL-17可能与慢性HBV相关性肝病尤其是乙肝肝纤维化的发生有明显的相关性.

罗格列酮对不同糖耐量老年患者内皮细胞功能的影响

目的:了解不同糖耐茸老年人内皮细胞功能状态以及罗格列酮治疗后的变化.方法:选择正常对照、IFG、IGT及2型糖尿病病人4组老年人,应用罗格列酮(4 mg/d,12周)治疗并观察内皮功能指标:C反应蛋白((:RP)、肿瘤坏死因子(TNF)、尿白蛋白排泄率(UAER)、Ⅰ型血浆纤溶酶原活化抑制剂(PAI-1)、假性血友病因子(vWF)、血浆血栓调节蛋白(TM)的变化和大血管并发症的危险因素-胰岛素抵抗水平的情况.结果:IFG、IGT及2型糖尿病组的CRP、TNF、uAER、PAI-1、TM、vWF水平均较对照组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).2型糖尿病组的CRP、TNF、uAER、PAI-1、TM、vWF较IFG、IGT组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).上述指标经罗格列酮治疗后呈不同程度的下降,治疗前后差异有统计学意义(P<0.05).血脂水平也有所改善.结论:罗格列酮可以调节炎症因子稳定血管内皮功能,也可以改善胰岛素抵抗所致的内皮功能障碍,进而减少心脑血管等并发症.

丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)诊断试剂盒质检评价分析

目的:对进口、国产2个厂家的6个不同批次试剂盒进行抽检,以保证试剂的质量,预防不合格试剂用于标本检测.方法:采用抽检的不同批次的试剂盒检测国家标准品考核血清盘,30份阳性血清,30份阴性血清和4份灵敏度血清,计算其灵敏度,特异性,相对符合率等指标.结果:进口抗丙型肝炎病毒(HCV)诊断试剂盒的6个不同批次试剂盒的特异性为99.6%,灵敏度为100%,相对符合率为98.33%;国产抗-HCV诊断试剂盒的6个不同批次,有1个批次的特异性为90.00%,灵敏度为86.66%,相对符合率为88.33%;其他5个批次的特异性为100%,灵敏度为96.66%,相对符合率为98.33%.结论:进口试剂所有批次全部合格,国产试剂有1个批次不合格,退回厂家.影响试剂质量的因素是多方面的,经国家有关部门检定合格的试剂,在投入使用之前必须进行抽检,确保检测结果可靠.

STAT3信号转导途径在肺腺癌细胞中的表达活化

目的:分析STAT3、CyclinD1、CyclinB1、Bcl-2蛋白在人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞HELF中的表达情况,探讨STAT3、CyclinD1、CyclinB1及Bcl-2蛋白在肺腺痛发病机制中的作用.方法:采用Western blot检测人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞HELF中STAT3、CyclinD1、CyclinB1及Bcl-2蛋白的表达.结果:STAT3、CyclinD1、CyclinB1、Bcl-2蛋白在人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞HELF中均有表达,且在两组细胞中的表达相比较均有统计学意义(P<0.05):在人肺腺癌细胞A549中,STAT3蛋白的表达与Cy-clinDl和Bcl-2蛋白的表达成线性相关,而与CyclinBl蛋白的表达则无明显相关性.结论:STAT3信号转导通路可能在肺癌的发生中起着重要的作用.

APL相关TCR Vα 6、Vα10和Vβ23寡克隆T细胞CDR3序列分析

目的:分析急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周m TCR Vα和Vβ克隆性增殖T细胞及CDR3序列特点.方法:利用RT-PCR法扩增1例APL患者外周血单个核细胞中29个TCR Vα基因和24个Vβ基因CDR3,阳性PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析确定其CDR3长度,了解其克隆性;寡克隆的PCR产物再进行CDR3区序列分析.结果:该例APL患者外周血T细胞分别在TCR Vα6、Vα10和Vβ23亚家族中出现寡克隆性增殖T细胞,经序列分析显示TCR Vα6、Vα10和Vβ23亚家族基因序列分别为Vα6NJα17、Vα10NJα35和Vβ23NDβ1NJβ2.7,其CDR3区氨基酸序列分别为CAMRENSAGNK,YLCAGDELLWECA,CASSSKWAG-GTYEQY,该3个TCR基因已被GenBank收录(登陆号:EU544946、EU544947和EU647219).结论:APL患者外周血T细胞出现的TCR Vα6、Vα10和Vβ23克隆性增殖T细胞可能是机体对抗白血病细胞所引起的抗原特异性免疫反应;这3个独特TCR重排序列将进一步作为开展APL特异性免疫治疗研究提供资料.

Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选与初步鉴定

目的:构建针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系噬菌体抗体库,从中筛选特异性抗体,并对所筛选出的阳性克隆进行鉴定.方法:以Daudi细胞免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗血清滴度后,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞,提取RNA.利用RT-PCR扩增抗体к轻链和重链Fd片段,经Sac Ⅰ/Xba Ⅰ和Xho Ⅰ/Spe Ⅰ双酶切,依次克降入噬菌体载体pComb3H-SS的相应酶切位点,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库.以Daudi细胞为抗原对抗体库进行6轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过ELISA法对随机挑选的克降进行抗原结合活性测定,获得的阳性克隆进一步做DNA序列测定、在大肠杆菌XL1-Blue中进行可溶性表达,并用Western blot对表达产物的特异性作了鉴定.结果:构建了容量为3.13 × 107的抗人B细胞淋巴瘤Daudi细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Daudi细胞系特异性识别结合的4株阳性克隆.氨基酸序列分析结果显示:阳性克隆的重链、轻链可变区序列分别与基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链、轻链可变区序列有80%～94%和88%～95%同源性.阳性克隆成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达,Western blot结果表明所获得的可溶性表达产物可与Daudi细胞膜抗原特异性结合.结论:成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Daudi细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础.

抗人羧酸酯酶-Ⅱ多克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:构建人羧酸酯酶-Ⅱ(hCE-Ⅱ)原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体(pAb),并对其特性进行初步鉴定.方法:以人正常肝cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-GST)和pET-32a-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-His).在宿主菌BL21内进行诱导表达,hCE-Ⅱ-GST融合蛋白作为免疫原免疫大耳白兔,用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用间接ELISA、West-ern blot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性.结果:成功制备了抗hCE-Ⅱ的多克隆抗体.Western blot鉴定表明该抗体可特异性识别重组蛋白以及天然的人肝微粒体蛋白.免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性结合肝包浆中的hCE-Ⅱ蛋白,而不与血管平滑肌细胞结合.结论:制备的pAb有较高的效价和较好的特异性,为肝癌诊断试剂盒的研究奠定了实验基础.

破伤风毒素C片段单克隆抗体的研制

目的:研制抗破伤风毒素C片段(TetC)的单克隆抗体(mAb).方法:以纯化蛋白His-TetC免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆.Westernblot鉴定mAb的特异性,并用mAb亚类试剂盒鉴定mAb亚类.结果:共获得5株稳定分泌抗TetC的杂交瘤细胞株,分别命名为1E5、5G10、689、7D6、7F5,其腹水效价除1E5为3×210外,其余均为1×105,亚类鉴定结果均为IgG1.West-唧blot分析结果显示,5株mAb均与融合蛋白His-TetC发生特异性反应.结论:成功制备了抗TetC的mAb,为进一步研究TetC的生物学功能、破伤风毒素结构与功能的关系以及建立快速检测破伤风抗毒素水平的方法奠定了基础.

应用核糖体展示技术筛选制备抗TNF-α人源抗体的研究

目的:构建人源核糖体展示抗体库,筛选制备抗TNF-α的特异性、高亲和力三结构域抗体(VH/K).方法:应用核糖体抗体库技术,从类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞中分离、构建核糖体展示VH/K基因库;体外转录翻译后,以TNF-α重组蛋白作纯化抗原,采用亲和富集法淘选TNF-α特异性抗体基因;将筛选获得的VH/K基因克隆并在原核系统pET22b(+)/BL21(DE3)中实现可溶性表达;表达产物经进行ELISA鉴定,并对阳性克隆的生物学特性进行初步研究.结果:成功构建了库容量约为6.7×1012核糖体展示VH/K抗体基因库,在180个筛选克隆中,其中两株抗体TRB21、TRB409显示出极高的ELISA值,序列分析表明两株克隆具有全新的人源抗以TNF-α抗体基因,他们不仅可以特异识别TNF-α而且可以抑制以TNF-α对L929细胞的细胞毒性.结论:人源抗TNF-α特异性抗体的获得,为进一步研制抗TNF-α的特异性、高亲和力基因工程抗体奠定了基础.核糖体展示技术为体外筛选制备全人源抗体提供了一种简便、有效的技术平台.

抗PIP5KL1多克隆抗体的制备及鉴定

目的:构建人4-磷酸-磷脂酰肌醇-5-激酶(phos-Dhatidylinosito1-4-phosphate 5-kinases-like 1,PIP5KL1)质粒并在大肠杆菌中表达,纯化得到相对分子质量(Mr)为42 000的融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备兔抗PIP5KL1多克隆抗体.方法:采用PCR的方法获得编码人PIP5KL1的cDNA序列,将其克隆入pET-32a,构建pET32a-PIP5KL1表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导下表达6×His-融合蛋白,纯化后免疫新西兰兔,制备兔抗人PIP5KL1血清,以Western blot和ELISA方法分析其特异性和效价.结果:PIP5KL1融合蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体,West-em blot结果显示制备的抗体具有较高的特异性,ELISA显示效价为1:100 000.结论:获得了纯化的PIPSKL1融合蛋白和anti-PIP5KL1多抗血清,为今后对新基因PIP5KL1功能研究打下了基础.

白介素-6及其受体与心血管系统的研究进展

IL-6是一种具有分化和促进生长作用的多种生物活性的细胞因子,是参与机体各种调节的莺要细胞因子,IL-6与特异性IL-6受体结合,相互作用并激活心肌细胞丰富的信号转导受体复合物-gp130,发挥负性肌力和细胞毒作用,IL-6与动脉粥样硬化、冠心病以及心衰的发生、发展有着密切的关系.

分子鉴别诊断领域的革命性技术——Tem-PCR

分子鉴别诊断由于其高效、快速的特点,在公共卫生领域和个体化医疗中将发挥越来越蓖要的作用.分子鉴别诊断需要敏感、特异、可靠的多重扩增技术作为支撑,靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)正是这样一项技术,能在一个反应体系中同时对多种靶基因高度敏感和特异的扩增,为分子鉴别诊断在应对公共卫生危机、食品安全、病毒分型、细菌耐药性分析和个体独特型遗传背景检测等方而的应用带来革命性变化.

MicroRNAs:免疫系统的新型调节子

miRNAs是一类进化上保守的非编码小RNA,能在转录后水平对靶mRNAs进行降解或翻泽抑制,在多种牛物学过程中发挥重要调节作用.哺乳动物的免疫系统在抵抗感染、自身稳定和免疫监视方面发挥重要作用.为达到免疫应答和免疫耐受的恰当平衡,免疫反应的起始、终止和反应强度必须被严谨调节.相对于转录因子全开或全关的调节方式,miR-NAs更适合对免疫系统进行精细调节和定量调节.因为它们通过非常短的作用位点进行调节,在作用位点一个或少数几

免疫与骨质疏松症的关系以及骨质疏松症的筛选及诊断方法进展

骨质疏松症(osteoporosis,0P)是指以单位体积内骨量低于正常为特征的骨骼疾患,骨质有机成分生成不足、继发性钙盐减少及骨组织微细结构破坏是其主要表现.根据病因可将其划分为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症,原发性骨质疏松症又可分为绝经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症[1].骨质疏松症目前已成为世界性问题,是继肿瘤、心血管疾病之后又一严重危害人类健康的一种疾病.有研究显

NK细胞的选择性扩增

选择性扩增是对NK细胞免疫生物学特性和受体-配体相互作用深入研究的基础上提出来的.NK细胞不是均质性群体,表达不同膜表面分子的NK细胞在分泌细胞因子和杀伤活性等方面有所不同.另外,在NK细胞的KIR受体与HLA位点不相合的肿瘤免疫治疗中,不相合NK细胞的数量明显影响治疗的效果.因此有必要对NK细胞进行选择性扩增以提高NK细胞的杀伤效果.本文中总结了目前调节不同NK细胞亚群扩增的影响凶素,从而为NK细胞选择性扩增的可行性奠定基础.

硒酸软骨多糖对Hca-F荷瘤小鼠免疫功能的影响

植物多糖具有许多有益的治疗效果,如抗肿瘤、免疫调控、伤口愈合等.其机制被认为是通过调控天然免疫,特别是巨噬细胞的功能而达到的[1,2].但是对于动物来源的多糖,其研究相对较少.本实验室从猪软骨里提取了多糖,并进行了一系列的研究.

应用RAW264.7-L929细胞系建立一种新型抑制性ODN的筛选方法

目的:为研究拮抗TNF-α的新型免疫抑制性ODN建立一种快速的筛选方法.方法:以CpG ODN 1826作为刺激剂,将其作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞,6 h后收集上清,作用于L929细胞,利用L929是TNF-α敏感细胞的原理,检测TNF-α活性.结果:筛选条件确定为CpG ODN 1826终浓度为20 mg/L,RAW264.7上清液1/80倍稀释.放线菌素D浓度为1 mg/L,L929细胞数在2×104个/孔,反应时间为18 h.应用此条件成功筛选出自行设计的抑制性ODN-IM003.结论:建立的实验体系,能很好的区分自行没计的ODN抑制CpG ODN 1826诱导的RAW264.7细胞的TNF-α的生物学活性.

实时定量RT-PCR检测TCR Vγ亚家族基因表达水平

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时定鼍检测TCR Vγ亚家族T细胞表达水平的比较Ct法.方法:利用倍比稀释的成人正常胸腺组织cDNA建立TCR VγⅠ-VγⅢ和B2微球蛋白基因(β2M)基因的相对标准曲线,实验证实靶基因(VγⅠ-VγⅢ)分别和看家基因(B2M)的扩增效率一致,可采用比较Ct法对TCR Vγy Ⅰ～VγⅢ的表达进行相对定量,并运用该方法检测20例健康成人外周血TCR VγⅠ～VγⅢ的表达水平.结果:成人外周血 TCR VγⅡ的表达茸高,TCR VγⅠ次之,TCRVγⅢ的表达量低,三者比较有统计学意义(P<0.05).结论:本研究率先建立了利用sYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测人TCR Vγ基因mRNA表达水平比较Ct法,并在国内首先提供了健康成人外周血TCR Vγ基因各亚家族mRNA表达水平的资料.

狂犬病毒核蛋白基因的克隆及核蛋白主要抗原表位分析

目的:克隆狂犬病毒ERA株核蛋白基因并对核蛋白主要抗原表位进行分析.方法:根据GenBank中已发表的RV N基因序列,设计合成了1对特异性引物,对RV ERA株N基因进行了RT-PCR扩增.将PCR产物纯化后与pMD18-T连接得到重组质粒pMD-N,并进行核苷酸序列测定.结果:该基因全长1 353 bp,编码450个氨基酸.RV ERA株与Gen-Bank中RV不同固定毒株和分离毒株N基因相比,核苷酸的同源性为98.0%～99.6%,推导的氨基酸序列的同源性为98.3%～99.60A,.核蛋白主要抗原表位分析表明,ERA株与其他固定毒株和分离毒株相比,仅在BC抗原表位(369～383位氨基酸)和Th抗原表位(394～408位氨基酸)处有1～3个氨基酸的不同,其他表位无差异.但与Iagos bat、Mokola和Duvenhage毒株相比,抗原位点氨基酸组成差异明显.结论:RV ERA株N基因可用于基因工程疫苗研制和核酸检测的靶基因;核蛋白可作为抗原用于狂犬病的检测.

核呼吸因子-1在正常发育和视觉剥夺大鼠视皮层内的表达

目的:观察核呼吸因子-1(NRF-1)在正常发育及视觉剥夺大鼠视皮层内的表达.方法:构建视觉剥夺大鼠模型,利用半定量:PCR、Western blot及免疫组织化学的方法检测NRF-1在正常发育及视觉剥夺大鼠视皮层内的差异表达.结果:通过以上方法均可检测到视觉剥夺大鼠视皮层内NRF-1表达明显降低.结论:NRF-1的基因转录及蛋白表达水平依赖于正常视觉信号的刺激,异常的视觉经验使视皮层神经元兴奋性降低,造成NRF-1表达的明显下调.

一群分泌IL-9-IL-10新的CD4+T细胞群

调节性树突状细胞研究进展

树突状细胞(dendritic cells,DCs)是体内作用强的抗原递呈细胞,成熟DCs能够加工和递呈各种抗原,并通过一些固有免疫受体如Toll样受体识别病原微生物表达的模式分子,以及通过主要组织相容件抗原复合物(MHC)和共刺激分子的表达,引起初始T细胞的活化、增殖.然而,越来越多的证据表明,体内存在着能够负向调节免疫应答强度、维持免疫耐受的DCs,并且命名为调节性DCs(regulatory DCs).