草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-IZP3-C3d3的构建表达及其免疫不育的研究

目的:构建草原兔尾鼠卵透明带3 DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-IZP3-C3d3进行小鼠的黏膜免疫,增强该疫苗的免疫不育效果.方法:将两种佐剂分子大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基和C3d基因通过酶切鉴定,构建重组质粒pVAX1-sig-LTB-IZP3-C3 d3,采用RT-PCR和Western blot技术,检测其在mRNA和蛋白水平的表达,并通过肌肉注射、滴鼻和灌服3种途径免疫雌性C57BL/6小鼠,通过ELISA检测抗体水平及分型.结果:酶切鉴定,RT-PCR和Western blot 结果表明重组质粒构建正确并可在mRNA和蛋白水平的表达,ELISA结果表明以重组质粒pVAX1-sig-LTB-IZP3-C3d3免疫诱导的特异性IgG、IgA的水平明显高于对照组(P＜0.01)o抗生育实验表明该疫苗免疫的小鼠平均生仔数与对照组相比差异极显著(P＜0.01).结论:构建的草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗重组质粒pVAX1-sig-LTB-IZP3-C3d3可高效地激发小鼠特异性免疫应答,提高抗生育的效果.

卡介苗对hPBMC的TLR4表达调节及其免疫活化作用的研究

目的:了解卡介苗对人外周血单个核细胞( hPB-MC) TLR4的表达调节,以及BCG介导免疫细胞活化效应的新机制.方法:研究BCG对hPBMC的TLR4表达的调节,以及对表达TLR4的淋巴细胞的免疫活化效应,以(hPBMC+PBS)作为空白对照组,应用流式细胞仪对TLR4进行检测,ELISA方法测定BCG刺激组与对照组的IFN-γ和TNF-α的表达.结果:经过BCG刺激后,TLR4表达大大增加(P＜0.01),且随时间增加而增强,在72 h时,BCG组的TLR4表达率为(44.73±0.0066)％,而对照组的表达率仅为(1.02±0.0024)％.BCG可以促进淋巴细胞增殖,且这种增强作用也存在一定时间依赖性,在BCG与hPBMC共同孵育24h、48h和72h后,BCG组IFN-γ和TNF-α的表达量显著高于对照组(PBS组),差异有统计学意义(P＜0.05),且这种增强作用存在一定的时间依赖性.结论:BCG对hPBMC的TLR4表达有正调节作用,并加强表达TLR4的hPBMC的免疫活化作用.

周围血中CD3+TCRvα24+与CD3+TCRvβ1+NKT细胞之间的差异

目的:比较正常人周围血中CD3+ TCRvβ11+ NKT 细胞和CD3+ TCRvα24+ NKT细胞在频率、亚群、表型特征及功能方面的异同,以进一步了解NKT细胞在免疫应答中的作用.方法:分离正常成年人PBMCs,利用流式细胞术(FCM)检测TCRvα24、TCRv1β11、CD4、CD8、CD45RA、CD62L和CCR7表面分子的表达；PMA+ Ionomycin刺激PBMCs后,检测CD3+ TCRvα24+、CD3+ TCRvβ11+NKT细胞产生细胞因子IL-4和IFN-γ的情况.结果:PBMCs中CD3+ TCRvα24+和CD3+ TCRvβ11+NKT细胞的平均频率分别为0.63％和0.43％,NKT细胞频率的个体差异较大,少数细胞同时表达TCRvα24和TCRvβ11；根据CD4和CD8分子的表达,PBMCs 中CD3+ TCRvα24+ NKT细胞可分为CD4+、CD8+、CD4-CD8-3个亚群,平均频率分别为64.35％、19.04％、17.18％,CD3+ TCRvβ311+ NKT细胞同样可分为CD4+、CD8+、CD4-CD8-3个亚群,其平均频率分别为53.69％、18.99％、29.74％,相应各亚群之间无显著差异；CD45RA+ CD3+ TCRvβ11+ NKT细胞的频率(71.14％)要高于CIM5RA+ CD3+ TCRvα24+ NKT 细胞的频率(46.55％),二者之间差异有显著性,CD62L+CD3+ TCRvα24+ NKT (46.26％)对CD62L+ CD3+ TCRvβ11+NKT(42.36％)以及CCR7+ CD3+ TCRvα24+ NKT(9.24％)对CCR7+ CD3 +TCRvβ11+NKT(8.22％)之间的差异均无统计学意义；细胞因子检测的结果表明CD3 +TCRvα24+ NKT细胞和CD3+ TCRvβ11+NKT细胞产生的IL-4( 13.01％对6.62％)和IFN-γ(38.12％对26.95％)的总体水平间无显著性差异,但是IFN-γ+ IL-4+ CD3+ TCRvα24+NKT细胞的平均频率(12.65％)要高于IFN-γ+ IL-4+ CD3+ TCRvβ11+NKT细胞的平均频率(3.02％),且二者之间的差异有统计学意义.结论:正常人周围血中CD3+ TCRvα24+ NKT细胞和CD3+TrCRvβ11+NKT细胞在频率、表型及产生细胞因子方面均有一定差异,总体来看,二者频率虽小但表型复杂,产生细胞因子IFN-y和IL-4的水平高,参与免疫调节及免疫应答的过程.

肺炎嗜衣原体Cpn0810重组蛋白诱导THP-1细胞产生促炎因子和凋亡的研究

目的:在E.coliBL21中表达肺炎嗜衣原体Cpn0810,并研究该蛋白能否诱导人单核细胞( THP-1)产生TNF-α和IL-6等促炎因子和细胞凋亡.方法:PCR扩增Cpn0810蛋白编码基因,构建pGEX6p-2/Cpn0810重组质粒,在E.coliBL21中诱导表达,经ToxinEraser纯化柱纯化后,用不同浓度的GST-Cpn0810作用THP-1细胞,ELISA法检测TNF-α和IL-6的水平,Hoechst33258荧光染色、AnnexinV-F1TC-PI染色法检测细胞凋亡情况.结果:构建了重组质粒pGEX6p-2/Cpn0810,并在E.coliBL21菌中高效表达.该蛋白能诱导THP-1细胞以时间、剂量依赖方式表达TNF-α和IL-6；当10mg/L GST-Cpn08 10处理THP-1细胞24h后,形态学上,细胞表现为皱缩、核碎裂、细胞起泡及凋亡小体等凋亡特征.结论:表达并纯化的Cpn0810蛋白能诱导THP-1细胞分泌TNF-α和IL-6等促炎因子和诱导其发生凋亡.

玉米赤霉烯酮半抗原及全抗原的合成与鉴定

目的:合成玉米赤霉烯酮(ZEN)半抗原及全抗原,并鉴定其是否合成成功,为制备ZEN抗体奠定基础.方法:将ZEN与羧甲氧基胺半盐酸盐(0-( carboxymethyl)hydroxylamine hemihydrochloride)反应,合成半抗原ZEN-6-羧甲氧基胺(ZEN-oxime),采用TLC、HPLC和液相-质谱联用技术进行半抗原的纯化、鉴定；通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备ZEN全抗原,采用紫外光谱法、TNBS法结合比的测定以及免疫学方法进行全抗原鉴定.结果:鉴定结果表明目标半抗原及全抗原合成成功.结论:本研究采用多种方法进行半抗原及全抗原的鉴定,结果皆表明目标半抗原及全抗原合成成功,说明本研究合成ZEN半抗原及人工抗原的技术路线是可行的,为进一步研制ZEN的抗体奠定良好基础.

姜黄素对IL-17诱导的人角质形成细胞NO合成以及iNOS表达的影响

目的:探讨姜黄素对IL-17诱导的人表皮角质形成细胞株(HaCaT细胞)NO合成以及诱导型一氧化氮合酶(iN-OS)的mRNA和蛋白表达的影响.方法:用IL-17刺激体外培养的HaCaT细胞,并分别加入3种浓度的姜黄素共培养24h.并收集细胞上清液、提取细胞总RNA、总蛋白,分别进行NO含量的测定、荧光定量PCR和Western blot实验,明确姜黄素对NO含量以及iNOS表达的影响.结果:IL-17能够有诱导HaCaT细胞NO以及iNOS的表达(P＜0.01).姜黄素有效下调NO合成量以及iNOS的mRNA(P ＜0.01)及蛋白表达(P＜0.01)水平.结论:姜黄素对IL-17诱导的HaCaT细胞NO分泌及iNOS的表达具有明显的抑制作用,从而为其对角质形成细胞相关的皮肤炎症性疾病的治疗提供了理论依据.

Trim6真核表达载体的构建及表达

目的:构建人Trim6的真核表达载体pcDNA3.1(+ )-Trim6,并观察其在HEK293T细胞中的表达.方法:提取HeLa细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim6编码区全长基因片段,克隆到pcDNA3.1(+),通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定.将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹检测Trim6蛋白的表达.结果:通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建人Trim6表达载体,该载体可以在HEK293T细胞细胞系中表达Trim6.结论:构建Trim6真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim6,为研究Trim6在固有免疫应答中的作用奠定了基础.

人DRR1真核表达载体和稳定转染HEK293细胞株的建立及鉴定

目的:构建人DRR1基因的真核表达载体,通过转染HEK293细胞建立稳定的DRR1表达细胞株.方法:通过改造质粒pIRES,在其MCS1和MCS2中分别引入串联亲和纯化标签和绿色荧光蛋白基因,形成一个新的表达质粒pFSIG.将PCR扩增的DRRl1基因插入pFSIG中进行酶切和测序验证.用重组质粒pFSIG-DRR1转染HEK293细胞,通过G418和绿色荧光检测筛选DRR1稳定表达细胞株.通过Westernblot鉴定FS-DRR1蛋白的表达.结果:酶切、PCR和测序证实成功构建了pFSIG-DRR1表达质粒；建立了稳定转染的HEK293细胞系,Western blot检测证明重组DRR1在该细胞系中成功表达.结论:融合有串联亲和纯化标签的DRR1真核表达载体的构建和稳定表达细胞HEK293株的建立为在生理条件下研究DRR1的相互作用蛋白奠定了基础.

转录因子FOX04在大肠癌中的表达及意义

目的:探讨叉头样转录因子04( FOX04)在大肠癌组织中的表达及其临床意义.方法:选取80例大肠癌患者手术切除肿瘤及其癌旁组织标本(TNM分期:Ⅰ期18例,Ⅱ期32例,Ⅲ期24例,Ⅳ期6例),应用免疫组织化学染色方法检测FOX04在大肠癌和癌旁组织的表达情况,并分析其与患者临床病理特征的关系.结果:FOX04在大肠癌组织中的阳性表达率为47.50％ (38/80),明显低于在癌旁组织91.25％(73/80)的表达率(P＜0.01).在肿瘤组织中FOX04表达水平在患者年龄、性别,肿瘤大小和侵润深度之间的差异无统计学意义(P＞0.05)；但与肿瘤分化程度、分期和淋巴结转移之间差异有统计学意义(P＜0.05).结论:FOX04在大肠癌中表达明显降低或缺失,提示其可能在大肠癌的发生、发展过程中起抑癌基因的作用.

血管紧张素-(1-7)对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)表型转化及细胞外基质分泌的影响.方法:体外培养NRK52E细胞,经Ang-(1-7)和AntgⅡ(终浓度均为1×10-6 mol/L)干预24、48、72、96 h后,应用细胞免疫化学法检测E-cadherin,α-SMA的表达；应用ELISA法检测细胞上清液中Ⅰ型胶原(Col I)和纤维黏连蛋白(FN)的表达；采用实时荧光定量PCR( Real-timePCR)检测细胞中E-cadherin、α-SMA、Col I和FN mRNA表达水平的变化.结果:AngⅡ作用96h后,E-cadherin蛋白及mRNA表达显著减弱(P＜0.05),α-SMA、Col I、FN蛋白及mRNA表达显著增强(P＜0.05)；同时加入Ang-(1-7)后,与AngⅡ组比较,E-cadherin蛋白及mRNA的表达增强(P＜0.05),α-SMA、Col I、FN蛋白及mRNA表达减弱(P＜0.05).结论:Ang-(1-7)能够抑制AngⅡ诱导的大鼠肾小管上皮细胞表型转化及细胞外基质的分泌.

肺部恶性肿瘤患者CD4+CD25+Treg等指标的临床测定及意义

目的:探讨研究肺部恶性肿瘤患者CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)等指标的临床测定及意义.方法:对我院2008-12/2010-08呼吸科或胸外科收治的86例肺癌患者为研究对象作为研究组,与本院同期收治的门诊体检健康人群81例作为对照组进行了对比研究.结果:研究组患者的外周血CD4+ CD25+ Treg占CD4 +T细胞的比例水平显著高于对照组健康人群且具有统计学差异.对于不同临床分期的肺癌患者CD4+ CD25+ Treg水平比较发现,Ⅰ～Ⅱ期患者较对照组高但无统计学差异,而Ⅲ期、Ⅳ期患者则显著高于对照组与Ⅰ～Ⅱ期患者水平.对于不同病理类型的肺癌患者外周血CD4+CD25+ Treg水平对比发现,腺癌、鳞癌及小细胞癌患者显著高于对照组,并具有显著的统计学差异.结论:CD4+ CID25+Treg的水平与肺癌的进展密切相关,同时还与肿瘤分期存在直接关联,通过抑制肿瘤免疫可以使得肿瘤发生免疫逃逸,进而提示去除人的CD4+ CD25+Treg或是一种有效的治疗肿瘤的免疫方法.

抗核抗体谱检测的临床诊断意义

目的:分析抗核抗体线性免疫印迹分析法( ANA-LIA)和抗核抗体间接免疫荧光法在自身免疫性疾病临床的诊断价值.方法:ANA-LIA使用德国IMTEC公司IMTEC-Human GmbH抗核抗体谱试剂检测；抗核抗体用间接免疫荧光法检测.结果:用间接免疫荧光法检测抗核抗体300例,用免疫印迹法检测抗核抗体谱263例,ANA荧光法与ANA-LIA免疫印迹法检测阳性结果无显著性差异(P＞0.05)；30例同时进行ANA、ANA-LIA检测,结果一致率73.3％；ANA-LIA漏检率20％,错检率6.7％.结论:以间接免疫荧光法检测抗核抗体缺乏特异性,而抗核抗体谱免疫印迹法具有高特异性,但存在着较高的漏检率,因此在临床实际应用中将两种方法联合应用,检测效果更好.

出血性脑损伤患者脑脊液和血清中S100β蛋白的意义

目的:观察脑出血患者CSF和血清中S1001β蛋白含量的变化及其临床意义.方法:以25例腹股沟疝和大隐静脉曲张患者作为25例脑出血患者对照组,取CSF和血清；将24只家兔随机分为两组(每组12只),一组实验组,另一组为假手术组.分别于实验性脑出血后6h、12 h、24h、48 h、72 h、96h等各时间点取各组CSF和血清,采用ELISA法测定S1001β蛋白的含量.结果:脑出血患者急性期与恢复期脑脊液中S1001β蛋白的水平明显高于对照组(P＜0.01)；也明显高于血清S100β蛋白的水平(P＜0.01)；不同时间点兔脑出血模型实验组脑脊液中S1001β蛋白的水平明显高于假手术组(P＜0.01).结论:脑出血后S100β蛋白在脑脊液中持续时间较长,且含量显著增高,可作为出血性脑损伤的早期诊断、指导治疗、判断预后的检测指标.

Ⅱ型糖尿病肾病患者血清IL-6、TNF-α、NO与ET的水平变化及临床意义

目的:探讨2型糖尿病肾病患者血清中IL-6、TNF-α、一氧化氮(N0)和内皮素(ET)水平及其临床意义.方法:采用相关试剂盒,按其说明书检测93例2型糖尿病患者血清IL..6、TNF..α、NO与ET水平.结果:单纯糖尿病组(SDM组)、隐性糖尿病肾病组(IDN组)、显性糖尿病肾病组(ODN组)IL-6、TNF-α与ET水平较对照组明显升高,其中ODN组高(P＜0.O1).SDM组、IDN组、ODN组NO较对照组明显减少(P＜0.O1),其中ODN组少.IL-6与UAER、TNF-α、ET均成正相关,NO与IL-6、TNF-α呈负相关.结论:IL-6、TINF-α、NO与ET可能参与2型糖尿病肾病的发病及病理变化过程,检测患者IL-6、TNF-α、NO与ET水平可作为判断预后、指导治疗的指标.

不明原因习惯性流产妇女外周血、蜕膜和绒毛组织TNF-a表达

免疫因素在不明原因习惯性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)妇女中的致病作用已逐渐被学者认知,外周血、蜕膜和绒毛组织都是孕早期母体和胚胎直接接触部分,在孕早期这些位置的免疫细胞数量、活性及其所分泌细胞因子对维持正常妊娠扮演着至关重要角色,肿瘤坏死因子-α(TINF-a)是其中较重要细胞因子之一.我们观察了25例育龄期RSA妇女外周血、蜕膜和绒毛组织中TNF-α表达变化,并与同期正常怀孕后人工流产妇女相同检测结果比较,报道如下.

血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子在急性白血病患儿血清中的表达及意义

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)急性白血病(AL)患儿血清中的表达及其与临床意义.方法:采用ELISA方法检测40例初治AL患儿化疗前及治疗1疗程后37例患儿和40例健康儿童血清中VEGF和bFGF的水平.结果:治疗前,AL组以及ALL组、ANLL组血清VEGF和bFGF水平均显著高于对照组(P＜0.05),而血清VEGF和bFGF水平在AL不同类型之间差异无统计学意义(P＞0.05).治疗前,AL缓解(CR)和未缓解(NR)患儿血清VEGF和bFGF水平差异无统计学意义；治疗后,CR患儿血清VEGF和bFGF水平显著下降,与治疗前和NR患儿比较均有显著性差异(P＜0.05)；而NR患儿治疗前后血清VEGF和bFGF水平差异无统计学意义.结论:VEGF和bFGF在AL患儿血清中呈高表达,血清VEGF和bFGF水平可作为AL患儿疗效观察指标,并且与患儿的预后有关.

细胞因子抗体芯片筛选脓毒症患者血清蛋白标记物

目的:应用细胞因子抗体芯片(CAC)分析脓毒症患者血清中炎性细胞因子表达的变化.方法:采用CAC技术平台,测定9例脓毒症患者(脓毒症组)和4例正常健康人(对照组)血清中79种细胞因子.以两组样本中每组至少有4个样品的杂交信号值超过400为有表达的蛋白,筛选出有表达的蛋白38个.应用芯片差异显著性分析(SAM)软件对38个有表达的蛋白进行差异表达分析.结果:筛选到胰岛素样生长因子结合蛋白-1( IGFBP-1)、肝细胞生长因子(HGF)、骨桥蛋白(Osteopotin)、胰岛素样生长因子结合蛋白-4(IGFBP-4)、干扰素诱导蛋白-10( IP-10)和B淋巴细胞趋化因子(BLC)等6个在脓毒症患者血清中高表达的细胞因子,以及血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、脑源性神经营养因子(BDNF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP-11β)、白细胞介素-8( IL-8)、表皮生长因子(EGF)和白介素-1β(IL-1β)等6个在脓毒症患者血清中低表达的细胞因子.聚类分析表明,上述这12个差异表达的细胞因子能够区分脓毒症和正常健康对照.结论:CAC是一种高效、快速的蛋白质组学技术,利用CAC从血清中筛选脓毒症相关蛋白分子标记物是可行的.

VEGF受体抑制剂对Ⅰ型糖尿病肾病大鼠足细胞病的治疗作用

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂SU5416对糖尿病肾病足细胞病的治疗作用.方法:SPF级SD雄性大鼠共30只,设为正常对照组(NC)、糖尿病肾病模型组(DN)、SU5416治疗组(SU5416),每组10只.DN大鼠由链脲菌素(STZ)诱导形成.SU5416治疗后第8周,分别测定大鼠体重( body weight,BW)、肾重(kidney weight,KW)、血糖( glucose,Glu)、大鼠24h尿蛋白排泄率(24 h UAER)和血肌酐(Scr).免疫荧光技术观察肾脏足细胞标记蛋白nephrin和podocin表达,Real time-PCR技术检测nephrin、podocin和VEGF mRNA水平,并观察肾脏病理变化.结果:与NC组大鼠相比,DN组大鼠BW明显下降,KW增加显著(P＜0.05),24 h UAER、Glu和Scr均明显升高,肾组织VEGF mRNA水平明显升高,nephrin、podocin蛋白水平及mRNA水平明显下降(P＜0.05),肾小球基底膜增厚、系膜基质增生；SU5416治疗后大鼠肾脏病理改善,KW较DN组明显下降,24hUAER明显降低,nephrin、podocin蛋白水平及mRNA水平上调(P＜0.05),但BW、Glu、Scr和VEGF mRNA水平治疗前后无统计学差异(P＞0.05).结论:SU5416治疗能降低DN大鼠24 h UAER、改善肾脏病理表现和上调肾小球足细胞标记蛋白nephrin和podocin水平.表明VEGF受体抑制剂对DN的治疗作用与其足细胞保护有关,抑制VEGF活性可能成为控制DN足细胞病进展的治疗手段之一.

鼠疫耶尔森氏菌Pla蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:利用原核表达的鼠疫耶尔森氏菌Pla蛋白(rPla),通过杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体(mAb),为相关研究工作奠定基础.方法:大肠杆菌表达的Pla蛋白,包涵体经尿素反复洗涤纯化后免疫BALB/c小鼠,取血清抗体效价高的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,以表达Pla、表达GST、天然提取Pla 3种蛋白为抗原物,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,并结合Western blot对所获取mAb的特异性进行鉴定.结果:经间接ELISA筛选,获得3株能稳定分泌抗天然Pla蛋白mAb的杂交瘤细胞株,命名为15B8、14H4、19A4,亚类测定分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ链；腹水经间接ELISA法检测效价可达1:106:Western blot实验证实该3株mAb能特异性识别天然Pla蛋白.结论:成功获得了抗鼠疫耶尔森氏菌天然Pla抗原的特异性mAb,为进一步研究Pla蛋白及研发诊断试剂奠定了基础.

特异性过敏原TBt多克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备特异性苦荞主要过敏原TBt的多克隆抗体,为深入研究TBt分子中各结构域的功能奠定基础.方法:通过盐析,离子交换层析,分子筛层析等方法从苦荞种子中纯化出过敏蛋白TBt,免疫新西兰兔子,制备多克隆抗体.用间接ELISA、Western blot检测该抗体的效价和特异性；竞争ELISA研究IgG抗体对TBt过敏患者血清IgE的抑制作用.结果:间接ELISA法检测所制备抗体的效价达1∶256000左右；Western blot显示该抗体能与TBt蛋白特异结合；竞争ELISA表明制备的IgG抗体能够特异性抑制养麦过敏患者血清1gE与过敏蛋白的结合.结论:制备的TBt多抗血清具有较高的效价和良好的特异性,该多克隆抗体可用于TBt的免疫活性鉴定,为下一步研究该蛋白的分子特征及免疫治疗奠定了基础.

鼠抗人4-1BB单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的:鼠抗人4-1 BB分子功能性单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:以高表达人4-1 BB分子的转基因细胞293T/4-1 BB为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以293T/4-1BB为阳性抗体筛选细胞,293T/mock为阴性抗体筛选细胞,经免疫荧光标记和流式细胞术(FCM)分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人4-1BB分子mAb的杂交瘤细胞株；采用Western blot、间接免疫荧光法、竞争结合抑制试验、3H掺入和细胞凋亡分析等方法对mAb进行生物学特性的鉴定.结果:成功获得3株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BB mAb的杂交瘤细胞株,命名为1G5、4B11和9F11.对mAb的生物学功能的研究结果表明,3株mAb均能识别活化T细胞和单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)表达的4-1BB分子.mAb 4B11能有效地激发T细胞体外增殖、抑制其凋亡,并能促进Mo-DC体外扩增,上调CD80、CD83、CD86和CD1α的表达.结论:获得的3株分泌鼠抗人4-1BB mAb的杂交瘤,所分泌的抗体具有特异性地识别人4-1BB分子；其中4B1 1 mAb具有激发T细胞增殖及促进Mo-DC体外扩增与成熟的作用,为激发型4-1BB mAb.

人RGS22蛋白表达及多克隆抗体制备

目的:构建人RGS22真核表达载体,表达人RGS22蛋白,制备其多克隆抗体,以探讨其在精子发生和肿瘤转移中的作用.方法:以cDNA文库为模板,用PCR法扩增人的RGS22基因.将其克隆到原核表达质粒PET22b中,构建重组质粒PET22b-RGS22.将该重组质粒依次进行PCR、酶切鉴定及测序后,转化BL21菌,以IPTG诱导表达.表达产物用质谱鉴定.纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA测定滴度.结果:用PCR法扩增出3 800 bp的RGS22基因编码框,测序证实为人RGS22基因,并在BL21菌中表达RGS22重组蛋白,用亲和层析Ni柱进行纯化得到人RGS22蛋白.质谱分析其肽混合物的肽质量指纹谱,数据库检索证实为RGS22蛋白.用纯化的RGS22重组蛋白免疫小鼠2个月后,得到相应的多克隆血清抗体,经ELISA检测,滴度均能达到1/10万.结论:制备了RGS22的多克隆抗体,为进一步研究RGS22在精子发生中的作用创造了有利条件.

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.

抗OmpW单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗副溶血弧菌OmpW的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法:利用生物信息学方法分析多种病原弧菌的OmpW氨基酸序列,原核表达并纯化制备r-OmpW.以r-OmpW作为免疫抗原制备鼠mAb,以五种病原弧菌为筛选抗原.采用Western blot、流式细胞术(FCM)、间接ELISA法鉴定mAb的特性.结果:生物信息学分析表明OmpW是弧菌内高度保守的外膜蛋白.成功筛选到3株杂交瘤细胞株,其中,杂交瘤细胞株S5C10分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG3,腹水mAb效价达4.6×104.该mAb同时识别副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌,而与荧光假单胞菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌及大肠杆菌无明显的交叉反应.结论:制备的mAb可特异性识别上述5种病原弧菌,为进一步建立广谱弧菌的免疫学检测方法提供了工具.

利用人源化噬菌体抗体库筛选骨唾液酸蛋白的单链抗体

目的:从人源化噬菌体抗体库中筛选高亲和、特异结合人骨唾液酸蛋白(BsP)的人源可变区单链抗体(scFv).方法:采用噬菌体表面展示系统,以重组的BSP蛋白为包被抗原,从噬菌体可变区scFv中筛选特异性结合BSP的小分子scFv,经过3轮亲和富集筛选后,再用ELISA方法进一步鉴定与抗原BSP有特异结合活性的scFv阳性克隆,PCR扩增鉴定阳性克隆的插入轻、重链基因片段,并对阳性scFv分子测序和序列分析.结果:筛选得到的scFv片段可以特异地结合BSP蛋白,PCR扩增都得到了长为368 bp、527 bp和935bp的轻链、重链和轻链-连接片段-重链的基因片段,测序结果分析发现上述scFv片段在轻链有11处的氨基酸组成不同,在重链区域氨基酸组成则有3处不同.基因序列分析结果表明符合人源单链可变区抗体基因序列的结构特征.结论:利用噬菌体抗体库技术成功获得BSP蛋白的特异性人源单链可变区抗体.

锌指蛋白A20对炎症反应及恶性肿瘤相关性研究进展

免疫系统的慢性活化可以促进肿瘤的发生,近研究发现A20在淋巴瘤中可以作为一种重要的肿瘤抑制因子.A20同时是一种泛素编辑酶,可以减弱促炎症受体近端的信号转导.现就一些慢性炎症和肿瘤发生相关联的证据,以及A20调节炎症信号级联反应的机制作一综述.

负性共刺激分子BTLA在感染免疫的作用

共刺激分子家族是既包括以CD28为代表的促进T细胞的生长、分化和细胞因子产生的正刺激分子,也包括诱导和维持T细胞免疫耐受及凋亡的负刺激分子.正性和负性刺激分子在适当的时间和部位表达,为T细胞提供正性信号和负性信号,调控T细胞的活化、增殖、分化和功能成熟.其中传递负向信号的分子受到越来越多的重视,也不断发现一些新的成员.BTLA(Band T lymphocyte attenuator)为近年发现的负性共刺激分子,抑制或下调T细胞的活化和细胞因子的产生.其发挥抑制功能时与调节性T(Treg)细胞和树突状细胞(DC)存在一定关系,参与多种免疫性疾病的发生、发展.本文根据国内外的研究进展,对BTLA在感染过程中的免疫作用做简要综述.

PD-1信号的研究进展及在移植耐受调节中的作用

排斥反应是导致移植失败的重要原因,其本质是受者T细胞识别供者同种异型抗原产生免疫应答,从而损伤供器官并使之功能丧失.T细胞的活化除了需要抗原刺激外,还需要协同刺激分子的存在,阻断正性协同刺激信号或增强负性协同刺激信号均能使免疫应答减弱或诱导免疫耐受.PD-1是一种较新的负性协同刺激分子,它在移植免疫耐受中发挥了重要作用.现对PD-1及其配体的结构及生物学特性进行介绍,并对它们在移植免疫耐受中的作用进行讨论.

B细胞抗原受体信号转导途径研究进展

B细胞抗原受体(B cell antigen receptor,BCR)是由膜免疫球蛋白(mIg)和Igα/Igβ组成的异源寡聚复合体.前者识别抗原,后者转导mIg接受抗原刺激信号.BCR和一些辅助受体及辅佐分子共同完成对抗原的识别及信号转导.BCR信号转导与细胞增殖、分化,生物个体的生长、发育、遗传、疾病、衰老乃至死亡息息相关[1].BCR信号转导是信号转导研究领域的热点之一,早的BCR信号转导生物化学反应已经得到很好的证明,但近几年一些新技术应用于BCR信号转导研究,模拟抗原递呈在细胞表面上膜锚定抗原识别过程,从新角度认识了BCR信号转导的时空动态学[2].

基于gp41的HIV亚单位疫苗研究进展

艾滋病疫苗是当今时代具挑战性的科学难题之一,现有的以诱导体液免疫为目的的HIV-1抗原均难以诱导产生有效的、持续的广谱中和抗体.近年来,一些具有广谱中和活性的HIV单克隆抗体(mAb)的发现及其相应抗原表位的阐明,给以诱导HIV体液免疫的疫苗研究带来了新的希望.相比于gp120,HⅣgp41的序列更为保守,糖基化位点更少,更适合作为疫苗的抗原.本文综述了靶向gp41的广谱中和抗体及其抗原表位,并阐述了对目前国际上基于gp41的HⅣ亚单位疫苗设计思路及进展.

实验室血液分析仪的规范化探讨

随着经济条件的发展,各医院实验室设备逐步提高,各种类型的血液分析仪在国内普及,包括进口设备和国内设备.这些设备的应用不仅提高了检验质量和工作效率,更为主要的是为临床提供了为可靠的试验指标[1].而规范临床实验室的科学管理,从检验项目和技术准入,检验人员的资格认定到分析前质量保证,同时分析过程中的校准,室间质评,室内质控,标准化操作规程,到检验结果的记录和报告等临床试验管理均提出了明确要求,因此血液分析仪在临床实验室的操作中其科学性管理就有着重要的意义[2].我们科实验室布局,实验室管理,室内质控和室间质评,严格遵守GB/20469-2006(国家标准)《临床实验室设计总则》,卫生部发布的卫医发(2006)73号文件《医疗机构临床实验室管理办法》,GB/20468-2006《临床实验室定量测定室内质量控制指南》,GB/T 20470-2006《临床实验室室间质量评价要求》等行业标准,加强血液分析的科学管理并总结分析如下.

用于研究人凝血因子Ⅷ重链抗原表位的双色荧光免疫印迹分析法

目的:寻找更简便精确的方法来检测人凝血因子Ⅷ的抗原表位.方法:采用PCR技术从人凝血因子Ⅷ的克隆载体pENTR223.1/FVⅢ上克隆出FⅧ重链(FⅧ-N)的cDNA.将cDNA插入原核载体pET21a构建重组表达载体pET21 a-FⅧ-N,并转化大肠杆菌BL21( DE3),以IPTG诱导表达His-FⅧ-N融合蛋白.以表达产物免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗FVⅢ-N的抗血清.接着在重组表达载体pET21 a-FⅧ-N中引入内参Flagotag.对FⅧ-N进行定点突变,构建两个突变克隆N1和N2,对二者以及原FⅧ-N进行双色荧光免疫印迹分析.用双色红外激光成像系统进行扫描和定量分析,以绿荧光与红荧光的光密度比值表示突变克隆抗原性的大小.结果:双色荧光免疫印迹分析表明,突变克隆N1,N2的抗原性与原FⅧ-N相比均有显著下降(P＜0.05).FⅧ A2区的三个氨基酸残基Arg484,Arg489,Arg593对FⅧ-N 抗原性起着重要的作用.结论:成功建立了人凝血因子Ⅷ重链抗原表位检测的双色荧光免疫印迹分析法.

检测人可溶性疱疹病毒侵入介体双抗体夹心ELISA的建立

目的:建立快速、灵敏的检测人可溶性疱疹病毒侵入介体(HVEM)双抗体夹心ELISA.方法:在获得HVEM重组蛋白的基础上,制备兔抗人HVEM多克隆抗体,以HVEM单克隆抗体(mAb)和HVEM多克隆抗体(pAb)为双抗体,建立双抗体夹心ELISA.结果:建立的检测人可溶性HVEM双抗体夹心ELISA低检出限为3.91 μg/L,标准曲线范围7.81-250 μg/L,线性方程为y=0.0021x+0.1852,R2=0.9944.回收率在89.7％～92.8％之间,平均回收率为91.4％.批内变异系数＜1O％,批间变异系数＜15％.结论:建立的双抗体夹心ELISA快速、灵敏、简单,可满足实际工作需要.

肝窦内皮细胞的分离纯化及鉴定方法

肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)是肝脏非实质细胞(nonparenchymal cell,NPC)的主要细胞群,占这些细胞数的40％左右,由LSEC组成的肝窦壁是全身毛细血管壁中唯一缺乏基底膜的毛细血管,同时LSEC具有特殊的标志性结构-窗孔.肝窦内皮细胞不仅在形态上与其他血管内皮细胞不同,在功能上也有不同.肝窦内皮细胞组成肝窦壁,构成血流与肝细胞间的屏障,在调节肝窦血流与周围组织的物质交换中起有效的中枢性作用,对于维持正常的肝功能起十分重要的作用.在物质代谢方面,L.SEC在脂质、胆固醇和维生素A的平衡和分配方面具有重要的作用,同时能通过特异的内吞作用清除变性的大分子脂质、某些细胞外基质成分,在维持肝窦的正常生理功能方面发挥重要作用;在免疫方面,ISEC的位置使其可以第一时间与抗原接触,启动免疫应答,同时近年来发现LSEC能诱导T细胞免疫耐受,这在肝移植中有重要意义;此外,研究发现LSEC损伤在肝脏冷保藏和缺血再灌注损伤中占中心地位,而LSEC在缺血再灌注损伤以及冷保藏中的损伤机制也是近几年的研究热点.

应用流式细胞术对胃癌组织中CD44测定分析

目的:探讨CD44蛋白与胃癌细胞的关系.方法:应用流式细胞术测定胃癌组织CD44阳性细胞率和平均荧光强度.结果:在胃癌组织中,CD44细胞的阳性率为93.46±3.13％,明显高于其在正常组织的比率21.27±9.59％(P＜0.01)；胃癌组织中CD44蛋白阳性细胞平均荧光强度为175.58±49.21,和正常组织细胞CD44蛋白阳性细胞的141.02±113.44无差别(P＞0.05).结论:胃癌组织中,CD44蛋白增多表明其在胃癌的发生、发展和转移中可能发挥重要作用.

《细胞与分子免疫学杂志》2012年征订及投稿要求