抗间质上皮转化因子(c-Met)单价抗体的制备及生物学活性检测
摘要： 目的 用抗人间质上皮转化因子(c-Met)阻断型嵌合抗体ch3E1D7表达质粒构建单价抗体慢病毒穿梭质粒,利用慢病毒表达系统实现其在HEK293T细胞中快速表达,并对纯化后抗体的亲和力及中和活性进行检测.方法 设计抗c-Met的单价抗体,命名为mono3E1 D7,利用基因工程技术构建单价抗体三条链的慢病毒表达载体,磷酸钙法转染HEK293T细胞,表达的单价抗体经蛋白A琼脂糖4B亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测抗体完整性,ELISA检测单价抗体在体外阻断c-Met与其配体HGF结合的生物学活性.结果 感染单价抗体慢病毒的HEK293T细胞上清纯化后,SDS-PAGE分析可见55 ku的重链、25 ku的轻链以及30 ku的杵状结构链(Knob)三条带.且纯化后的单价抗体能与c-Met抗原结合,同时还具有阻断c-Met与HGF结合的中和活性.结论 成功获得抗人c-Met阻断型单价抗体.
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HMGB1通过TLR4促进心肌缺血损伤并调节脾脏CD4+、CD8+T细胞和Th17细胞比例
目的 探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)通过Toll样受体4(TLR4)调控心肌缺血损伤及对脾脏组织CD4+T细胞、CD8+T细胞及Th17细胞亚群的影响.方法 C57BL/6野生型小鼠(WT)和TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠各30只,随机分为对照组、异丙肾上腺素诱导心肌缺血(ISO)组和ISO联合重组HMGB1 (rHMGB1)组.采用心脏超声检查小鼠心功能,应用HE染色和天狼星红染色观察心肌组织病理学变化;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡指数,流式细胞术检测脾脏组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞和Th17细胞亚群的比例.结果 与对照组相比,ISO组小鼠诱发心脏功能损害、心肌组织坏死和纤维化、心肌细胞凋亡,脾脏组织中CI4+T淋巴细胞比例、CD4+/CD8+T细胞比值和Th17细胞比例升高;与ISO组小鼠相比,ISO联合rHMGB1组心脏功能损害、心肌组织坏死和纤维化、心肌细胞凋亡状况均加重,脾脏组织中CD4+T淋巴细胞比例、CD4+/CD8+T细胞比值和Th17细胞比例更高;与ISO联合rHMGB1组野生型小鼠相比,ISO联合rHMGB1组TLR4-/-小鼠心脏功能损害、心肌组织坏死和纤维化和心肌细胞凋亡减轻,脾脏组织CD4+T淋巴细胞比例、CD4 +/CD8+T细胞比值和Th17细胞比例显著降低.结论 HMGB1通过TLR4诱发心肌缺血时心肌组织损伤,并上调脾脏组织CD4+T细胞比例、CD4+/CD8+T细胞比值和Th17细胞比例,从而可能促进心肌组织炎症损伤.
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脂连蛋白降低氯化钴诱导的巨噬细胞凋亡及机制
目的 研究氯化钴(CoCl2)诱导的低氧条件下,脂连蛋白(APN)对RAW264.7巨噬细胞凋亡的保护作用及其机制.方法 巨噬细胞分为CoCl2处理组和APN预处理组,前者给予100 μmol/L CoCl2,后者先用(0.5、1、2)μg,/mL APN预处理2h,再给予100 μmol/L的CoCl2处理.CCK-8法检测各组细胞活力;免疫荧光法观察细胞胱天蛋白酶3(caspase-3)的分布及CoCl2和APN对其表达的影响;流式细胞术检测各组细胞的凋亡比例;分光光度计法检测各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量;Western blot法检测各组细胞B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、BAX、裂解型caspase-3(c-caspase-3)及低氧诱导因子lα(HIF-1α)蛋白水平.结果 与CoCl2组相比,APN预处理能提高细胞活力,减少细胞凋亡并升高SOD含量、降低MDA含量;Caspase-3主要分布在细胞膜上,与CoCl2组相比,APN预处理能上调Bcl2的表达,下调BAX、c-caspase-3及HIF-1α的表达.结论 APN可减少CoCl2诱导的巨噬细胞凋亡,可能是通过增强细胞内抗氧化活性,以及上调Bcl2、下调BAX、c-caspase-3及HIF-1α的表达来实现的.
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成人真皮成纤维细胞原代培养及鉴定
目的 探讨建立成人真皮成纤维细胞原代培养方法.方法 新鲜皮肤组织用分散酶Ⅱ(dispaseⅡ)消化,分离上皮和真皮层,分别采用组织块法和Ⅰ型胶原蛋白酶消化法分离真皮层成纤维细胞.用倒置相差显微镜观察细胞生长情况,波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞类型及纯度;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞周期分布.结果 培养48 h,经胶原蛋白酶分离得到的成纤维细胞95％以上贴壁,同时细胞开始从组织块边缘贴壁延伸生长.培养5d时,组织块周围有大量细胞贴壁增殖.细胞生长迅速,第7天,增殖细胞层铺满培养皿.组织块法分离的成纤维细胞中可混杂少量上皮细胞团,而胶原蛋白酶消化法分离的细胞波形蛋白阳性率接近100％,几乎均为成纤维细胞.结论 胶原蛋白酶消化和组织块法均是快速、经济、有效获取真皮成纤维细胞的方法.胶原蛋白酶消化法可以更有效避免上皮细胞污染,分离的真皮成纤维细胞有较好的增殖能力.
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敲低核仁小RNA宿主基因6(SNHG6)抑制舌癌细胞的增殖及上皮间质转化
目的 探究长链非编码RNA核仁小RNA宿主基因6(SNHG6)在舌鳞状细胞癌组织、Tca1183舌癌细胞中的表达及对舌癌细胞生物学特性的影响.方法 使用实时定量PCR检测舌鳞状细胞癌组织与正常组织、Tca1183舌癌细胞与正常舌上皮细胞中SNHG6的mRNA水平,分析舌癌临床病理指标与SNHG6表达的相关性.构建SNHG6干扰质粒并转染至Tca1183舌癌细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,集落形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测舌癌细胞凋亡变化;Western blot法检测细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白β联蛋白(β-catenin)、上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的蛋白水平.结果 与正常组织和正常舌上皮细胞相比,舌癌组织以及舌癌细胞中SNHG6的mRNA水平显著升高.舌癌组织SNHG6 mRNA水平与患者年龄和性别等不相关,与组织分化差、临床分期高和淋巴结转移呈正相关.干扰SNHG6在Tca1183舌癌细胞中的表达能够抑制癌细胞增殖以及促进细胞凋亡,且可以通过促进β-catenin和E-cadherin蛋白表达以及抑制N-cadherin和vimentin蛋白表达抑制Tca1183细胞EMT.结论 SNHG6在舌癌组织中高表达,敲低舌癌细胞中SNHG6能够抑制其增殖和EMT.
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白藜芦醇苷通过上调SIRT3和SDF-1延缓大鼠心肌纤维化
目的 观察白藜芦醇苷对阿霉素诱导心肌纤维化与免疫细胞因子表达的作用及机制.方法 雄性SD大鼠20只,随机分为4组,每组5只.对照组(常规喂养)、阿霉素组(腹腔注射2.5 mg/kg阿霉素,2次/周)、白藜芦醇苷组(腹腔注射50 mg/kg白藜芦醇苷,1次/日,其余处理同阿霉素组)、尼克酰胺组(腹腔注射500 mg/kg尼克酰胺,2次/周,其余处理同白藜芦醇苷组).Van Gieson染色法观察心肌纤维化,免疫组织化学染色法检测心肌组织1型胶原蛋白(Coll)、Co13表达,酶标法检测心肌羟脯氨酸(HYP)含量,试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)与还原型谷胱甘肽(GSH)水平,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、IL-10含量,反转录PCR检测沉默信息调节因子1(SIRT1)、SIRT3、基质细胞衍生因子1(SDF-1)与转化生长因子β(TGF-β)的mRNA水平,Western blot法检测心肌SIRT1、SIRT3、SDF-1与TGF-β的蛋白水平.结果 阿霉素促进心肌纤维化,降低心肌组织中IL-10的水平并抑制SIRT3、SDF-1 mRNA与蛋白表达,增加TNF-α、IL-1的水平并促进TGF-β mRNA与蛋白表达.白藜芦醇苷明显抑制阿霉素诱导的心肌纤维化效应,降低HYP与Col3水平,同时增加GSH与SOD含量,降低MDA含量.显著增加阿霉素诱导后心肌细胞SIRT3、SDF-1 mRNA与蛋白水平,抑制TGF-β表达,尼克酰胺能抑制白藜芦醇苷上述作用.结论 白藜芦醇苷可通过上调SIRT3表达提高抗心肌纤维化能力,降低阿霉素诱导氧化应激水平、抑制炎性细胞因子表达.
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α硫辛酸抑制6-羟基多巴胺诱导的PC12细胞中α突触核蛋白(α-synuclein)表达及机制
目的 研究α硫辛酸(α-LA)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病细胞模型中α突触核蛋白(α-syn)表达的影响及其机制.方法 采用6-OHDA诱导PC12细胞建立帕金森病细胞模型,用α-LA处理.噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性,比色法检测细胞内铁含量和细胞内丙二醛(MDA)含量,荧光探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平,Western blot法检测α-syn蛋白表达水平.结果 与正常对照组相比,模型组细胞活性显著降低,细胞内铁含量、MDA含量、ROS水平均显著增高,α-syn蛋白水平显著增加;与模型组相比,α-LA处理的细胞活性显著升高,细胞内铁含量、MDA含量、ROS水平显著降低,α-syn蛋白水平显著降低.结论 α-LA能抑制α-syn过表达,减轻6-OHDA诱导所致的PC12细胞损伤,这可能与α-LA降低细胞内铁含量、氧化应激水平有关.
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程序性死亡蛋白1(PD-1)在转染的HEK293T细胞的表达和鉴定
目的 优化HEK293T细胞转染条件,比较程序性死亡蛋白1(PD-1)在不同真核载体的表达水平以高效获取目标蛋白.方法 设计L9(33)正交试验,对细胞转染条件进行优化;扩增人PD-1胞外段基因,构建PD-1重组蛋白表达载体,瞬时转染HEK293T细胞,通过ELISA、Western blot对pCMV3、pcDNA3.1和pMH3三种真核表达载体的蛋白表达水平进行比较.结果 PD-1胞外段蛋白编码序列成功构建到pcDNA3.1和pMH3真核表达载体上,目的蛋白成功表达.在佳转染条件下,PD-1重组蛋白在pMH3中的表达量高,其次为pCMV3、pcDNA3.1的表达量低.结论 人PD-1胞外段蛋白在pMH3-PD1真核载体转染的HEK293T细胞中表达量高.
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巨噬细胞与血小板体外抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的增殖
目的 体外研究巨噬细胞与去白细胞单采血小板抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)增殖的效率,并初步探讨其作用机制.方法 将4×108个/mL MRSA接种至LB培养体系,分为血小板组(每升加入2×1011个去白细胞的单采血小板)、巨噬细胞组(每升加入1×109个体外诱导培养的巨噬细胞)、对照组(去白细胞单采血小板和巨噬细胞均不加).培养不同时间后,检测两组菌液的吸光度值以反映细菌的增殖情况,并在培养2h时采集菌液,倍比稀释后涂板计数细菌数量;流式细胞术检测血小板对MRSA的捕获,ELISA检测对照组和血小板组中的血小板因子4(PF4)的含量.结果 与对照组相比,巨噬细胞组和血小板组均可抑制MRSA增殖,且血小板组的作用更加显著.结论 血小板可以在体外抑制MRSA增殖,其抑制效果优于巨噬细胞.
关键词： 巨噬细胞 去白细胞单采血小板 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 -
罗格列酮通过抑制肠系膜脂肪组织炎症改善三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠结肠炎
目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮(rosiglitazone)对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎小鼠的治疗作用及可能机制.方法 选取雄性BALB/c小鼠20只建立TNBS结肠炎模型,造模成功后随机分为罗格列酮处理组及模型组,每组10只.罗格列酮处理组给予罗格列酮灌胃(0.2 mL,[20 mg/(kg·d)]),模型组给予生理盐水(0.2 mL/d)灌胃.处理6周后,处死所有小鼠.采用炎症性肠病疾病活动度指数(DAI)及HE染色结合Spencer结肠炎组织学评分评估两组小鼠肠道炎症程度及组织学改变,ELISA检测肠黏膜白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-10水平及肠系膜脂肪组织IL-6、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)水平;脂肪组织HE染色后200倍光镜下拍照依据比例尺计算脂肪细胞直径;免疫组织化学染色法检测小鼠肠系膜脂肪组织F4/80阳性巨噬细胞浸润数量、脂肪细胞成熟标志物外周蛋白(peripherin)、脂连蛋白(adiponectin)及瘦素(leptin)水平.Western blot法检测小鼠肠系膜脂肪组织核因子κB (NF-κB)和信号通路中的NF-κBp65、磷酸化的NF-κBp65(p-NF-κBp65)、磷酸化的NF-κB抑制蛋白(p-IκB)及磷酸化的IκB激酶(p-IKK)的蛋白水平.结果 罗格列酮处理后第5及6周,小鼠DAI评分显著低于模型组.同时,处理组小鼠肠黏膜IL-1β及TNF-α水平显著低于模型组,而IL-10水平显著高于模型组.与模型组小鼠相比,罗格列酮处理组小鼠肠系膜脂肪细胞直径及脂肪细胞成熟标志物perilipin水平均显著高于模型组.同时,罗格列酮处理组小鼠肠系膜脂肪组织巨噬细胞浸润数量及炎症介质IL-6、MCP-1水平均显著低于模型组.罗格列酮治疗显著促进处理组小鼠肠系膜脂肪细胞adiponectin的表达,而抑制leptin的水平.罗格列酮处理组小鼠肠系膜脂肪组织NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IKK及p-IκB蛋白水平均显著低于模型组.结论 罗格列酮可显著抑制TNBS模型小鼠肠道炎症,可能与抑制肠系膜脂肪组织NF-κBp65通路有关.
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稳定敲低Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)的BV2细胞系建立
目的 构建Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定敲低PPM1A表达的BV2小鼠脑小胶质细胞系.方法 针对PPM1A基因的编码序列(CDS)区,设计合成2对短发卡RNA(shRNA)序列shRNA1、shRNA2,分别将其克隆到GV493载体中,并转化至感受态大肠杆菌DH5α菌株,培养后挑取阳性克隆子进行测序,后包装慢病毒并进行滴度测定.将2组慢病毒分别转染BV2小鼠脑小胶质细胞,并给予嘌呤霉素筛选,使用荧光显微镜及流式细胞术观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,评估转染结果,分别采用实时定量PCR和Western blot法检测PPM1A的mRNA和蛋白水平.结果 PPM1A基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,转染BV2小鼠脑小胶质细胞后GFP表达率大于80％;与对照组相比,shRNA1及shRNA2敲低组PPM1A mRNA及蛋白水平均显著降低.结论 利用慢病毒shRNA方法成功构建PPM1A敲低的BV2细胞系.
