微卫星标记对WHBE兔封闭群、日本大耳白兔和新西兰兔的遗传分析

目的 分析比较大耳白黑眼兔(WHBE兔)封闭群与日本大耳白兔(JW兔)、新西兰兔(NZW兔)基因组存在的微卫星结构,研究WHBE兔封闭群的微卫星多态性.方法 利用21个微卫星位点,通过微卫星分子标记技术对WHBE兔封闭群、JW兔和NZW兔进行遗传多样性检测和对比.结果 根据初步结果,在21对微卫星引物中筛选出扩增产物稳定并且具有多态性的11对引物.WHBE兔封闭群在每个位点上的等位基因数为3-8个不等,11个位点的平均有效等位基因数为2.0402个,平均杂合度为O.4810;JW兔在每个位点上的等位基因数为2-8个不等,11个位点的平均有效等位基因数为3.6077个,平均杂合度为0.5039;NZW兔在每个位点上的等位基因数为3-9个不等,11个位点的平均有效等位基因数为2.6537个,平均杂合度为0.5334.WHBE兔封闭群在11个微卫星位点上的平均多态信息含量(PIC)为0.6005,多位点累积个体识别率达到100%,多位点累积非父排除概率(CPE)在双亲信息都是未知情况下的为0.9613,而在得知任-亲本信息的情况下,CPE值高达0.9973.在11个微卫星座位中,9个位点上出现了WHBE兔封闭群特有等位基因,其中在Sat2、Sat5、Sat7/、Sat12、Sat13、Sat16、S0144和INRACCDDV0003八个位点上WHBE兔封闭群的特有等位基因为一个,在Sat8位点上为两个.结论 WHBE兔8个位点的平均杂合度、平均有效等位基因数均比JW兔及NZW兔低,说明WHBE兔群体的基因纯合度高于其他两个品系,具有更优的遗传稳定性.9个WHBE兔特有的等位基因可作为区分WHBE兔封闭群和其它两个品系实验兔的分子标记.

阿尔茨海默病中mir-222作用机制的初步研究

目的 探讨mir-222在阿尔茨海默病发病机制中的作用.方法 取6月龄APPswe/PS△E9小鼠脑组织,进行microRNA芯片的检测;利用real-time PCR对芯片检测结果进行验证;构建mir-222表达载体,将其转染至SH-SYSY细胞中,转染后48小时提取蛋白检测p27kipl的表达情况.结果 芯片结果显示,与野生型C57BL/6J小鼠相比,6月龄APPswe/PS△E9小鼠脑组织中mir-222表达明显下降,经real-time PCR验证,差别具有统计学意义(P=0.012);将mir-222表达载体转染至SH-SY5Y细胞后,p27kipl表达减少.结论 mir-222可能通过调节细胞周期抑制因子p27kipl的表达参与阿尔茨海默病的发生.

长爪沙鼠β-防御素(defβ-83)基因的克隆与鉴定

目的 克隆长爪沙鼠β-防御素基因序列,并对其进行鉴定及分析.方法 从长爪沙鼠小肠中提取总RNA,根据GeneBank中大小鼠的β-防御素的基因序列,通过防御素基因的保守性设计引物,采用RT-PCR技术得到预期的PER产物,将所得的片段进行克隆、测序,并应用相关生物信息学软件对序列进行鉴定和分析,序列提交genbank.结果 Blast比较发现终测序的结果与小鼠β-防御素-1和大鼠β-防御素-1的同源性全都大于80%,genebank登录号为EU834052.结论 经测序鉴定证实该PCR产物为长爪沙鼠β-防御素基因1的一部分,本研究为深入探讨长爪沙鼠β-防御素的生物学活性奠定基础.

MDR1 基因单靶点双荧光素酶报告基因系统的建立

目的 通过构建以MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并进行活性分析,为MDR1基因表达的单靶点调控研究和逆转剂的筛选提供一种有效的方法.方法 从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子中Y-box序列.将该序列重组到萤光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1.将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中.通过调节不同载体的比例来优化转染效率.利用MDR1基因激活剂(热诱导)和抑制剂(EGCG)等处理来分析其启动转录活性受外界因素的影响.结果 通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子Y-box序列且没有出现碱基突变.在pGL-MDR1和pRL-TK的转染比例为5:5时,转染效率高并具有高的萤光素酶活性.通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反.结论 MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统建立成功.该系统不但可以用于研究活体生物发光成像和MDR1基因表达的机理,而且可用于单靶点的多药耐药抑制剂的筛选.

小鼠仙台病毒标准化血清的制备及鉴定

目的 制备标准化抗小鼠仙台病毒(Sendai Virus,SV)免疫血清,为清洁级及SPF级实验小鼠质量检测提供批量、稳定、敏感的质控血清.方法 使用动物来源的仙台病毒(SV)感染BALB/c小鼠,获得高效价免疫血清,经IFA、lEA、ELISA等方法检测血清效价.结果 制备多量抗SV血清,经多种方法检定,IFA效价达1:640,IEA效价达1:320,ELISA效价达1:102 400-1:204 800.结论 本研究中制备的SV抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为检测实验小鼠中SV病原的标准化质控血清.

无菌大鼠培育中无菌检测影响因素分析

目的 对无菌大鼠进行无菌检测,分析其微生物污染的多种影响因素.方法 通过采集无菌隔离器内环境、无菌大鼠及其粪便等标本,选用合适的培养基在不同的条件下对其进行培养,并于第7天和第14天转种于血平皿,以此来判断无菌动物的无菌状态,并分析出现微生物污染的影响因素.结果 在被检的163例标本中,检出阳性13例,且各平行样检测结果一致.经复检确认,阳性结果中有10例是动物自身带菌,3例是培养基污染.结论 本检测中所采用的培养基和方法准确可靠.检查用培养基质量、培养时间、标本处理等因素都可能影响无菌检测结果.

痘苗病毒毒力测定及其免疫血清的制备

目的 测试痘苗病毒毒力,制备痘苗病毒免疫血清,为药物评价和病毒检测奠定基础.方法 鸡胚绒毛尿囊膜培养痘苗病毒,测定病毒的TCID50和小鼠毒力.将痘苗病毒悬液稀释成100TCID50,0.2%福尔马林灭活,分别在0、7、14 d以腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠,用IFA、IEA、ELISA方法评价血清的敏感性和特异性.结果 痘苗病毒TCID50/0.0 5 mL=1.8×104,小鼠LD50/0.2 mL=106,8;制备的免疫血清经IFA法测定效价为1:320,IEA法测血清效价为1:160,ELISA测血清效价1:6400.结论 确定的细胞和小鼠毒力将为药物测定提供基础比对数据;制备的痘苗病毒免疫血清具有高度的敏感性和特异性,可作为测试对照血清使用.

庆大霉素诱导大鼠肾小管间质纤维化模型的建立

目的 探讨庆大霉素肾毒性损伤能否诱导一种新的肾间质纤维化模型.方法 31只健康雄性Wister大鼠随机分为4组:正常组I、模型组I(造模后5 d取材)组;正常组Ⅱ、模型组Ⅱ(造模后30 d取材)组.给予庆大霉素造成肾毒性损伤,分别于造模后5 d和造模后30 d处死,光镜和电镜下动态观察.肾组织形态学改变,计算肾系数、检测血肌酐、血尿素氮、24小时尿蛋白总量,氧化应激相关指标SOD、MDA、NOS的变化,检测NF-κB蛋白表达水平.结果 (1)模型组Ⅰ大鼠:光镜下可见肾小管上皮细胞以变性为主,部分坏死;有较多的蛋白管型和少量的细胞管型、颗粒管型.电镜下可见肾小管上皮细胞胞浆中有大量脂滴存在,细胞的线粒体肿胀、内质网明显扩张.肾系数常、血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白总量,以及MDA、NOS明显高于正常组I(P<0.01),模型组I NF-κB蛋白表达水平明显高于正常组I(P<0.01);SOD明显低于正常组I(P<0.01).(2)模型组Ⅱ大鼠:肾小管上皮细胞以坏死为主,部分上皮细胞变性,可见肾小管萎缩和扩张,有较多的细胞管型和颗粒管型,间质中有成纤维细胞增生和炎症细胞浸润,间质明显增宽.电镜下可见模型组Ⅱ大鼠肾小管上皮细胞核固缩、碎裂现象;间质中有较多的胶原纤维,成纤维细胞增多.模型组Ⅱ大鼠血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白总量明显高于正常组Ⅱ(P<0.01).结论 氧化应激引起的脂质过氧化损伤参与了庆大霉素所致的肾小管上皮细胞变性坏死,后者导致了慢性炎症和修复的反复进行,终导致肾间质纤维化.

混合喂养法建立营养性肥胖大鼠模型

目的 探讨用混合喂养法建立营养性肥胖大鼠模型.方法 142只雄性断乳SD大鼠按照体重随机分为对照组(普通饲料喂养,n=40)和模型组(高脂饲料+普通饲料混合喂养,n=102),单笼饲养,每周记录动物体重、体长及摄食量.以普通饲料组lee's index正常值上限x+t,a·s为肥胖确定标准,大于此上限为肥胖.结果 (1)混合喂养法中,大鼠自主平衡营养,根据需要选择普通饲料,根据喜好选择高脂饲料,能量摄入及能量利用率显著高于对照组;(2)混合喂养法能有效促进大鼠摄入和利用能鼍.14周末肥胖个体为52只,肥胖率为51%.(3)模型组肥胖个体与非肥胖个体比较,前者摄食量显著高于后者,其中以高脂饲料摄入增多为主,普通饲料摄人无差异,对高脂饲料的偏好两者无显著差异,但能量利用率前者显著高于后者.(4)与对照组相比,模型组血浆高密度脂蛋白、甘油三酯均低于对照组,总胆固醇及低密度脂蛋白则高于对照,血糖水平无差异.模型组脂肪肝的发生率达100%.结论 混合喂养法由动物自主择食,可摄取较多能量,是建立营养性肥胖大鼠模型的有效方法.

A Study of Changes in Uterine Leucocytes During Early Pregnancy in the Mouse-vole Interspesific Pregnancies

Mouse and vole embryos were allogeneically and xenogeneically transferred into pseudopregnant CD.1 and immunodeficient (seid)female mice,and we investigated the distribution of uterine leucocytes cells in the implantation sites on days 5,6,and 7 of pregnancy. Maerophages were evenly distributed in the endometrium on days 5-7.Neutrophils were rarely seen on days 5-7,but lymphocytes were found throughout the endometrium,often in groups associated with glands or the luminal epithelium.The number of uNK cells increased markedly at the mesometrial uriangle and the outer decidual area in the CD-1 uteri containing vole embryos;by contrast,seid uteri having vole embryos showed almost the same number as those having mouse embryos.Mast cells were present in large numbers at the myometrium,but rarely in the decidua in all types of pregnant uteri.Cells at the myometrium were more numerous in xenogeneic than in allogeneic transfer.Maay mast cells appeared in the inner decidua where xenogeneically transferred vole embryos were dead and aborted.These results suggest the possibility that uterine leucocytes mediate various immunological events in the mouse-vole interspesific pregnancies.

人工感染羊嗜流产衣原体豚鼠流产模型的建立

目的 通过人工感染怀孕豚鼠建立嗜流产衣原体发病模型,观察流产病理学变化的差异,确定豚鼠是否可以作为嗜流产衣原体的动物模型.方法 35只清洁级怀孕40d的豚鼠随机分为7组,每组5只.将羊嗜流产衣原体分离株B10011、CG1株分别以三个剂量组(10-1,10-2,10-3)腹腔攻毒1次,每只0.5 mL,以灭菌生理盐水为阴性对照.攻毒后观察豚鼠的临床体征、流产和死亡数量.攻毒后20 d安乐死处理剩余的大小豚鼠,无菌摘取组织,分成2份.一份-20℃冷冻保存,PCR检测病原在组织中的分布;另外一份固定于10%中性甲醛溶液,组织切片和免疫组化观察.结果 (1)羊嗜流产衣原体分离株B10011和CG1均可造成怀孕豚鼠流产、产弱胎、畸形胎或死胎.2种分离株感染不同剂量造成豚鼠平均流产时间、流产数量、豚鼠死亡数量均有显著差异,且CG1株敏感性高于B10011株.(2)2个分离株均可造成肾脏、肝脏肿大,肺脏呈局灶性出血,卵巢出血坏死,胎盘子宫阜水肿;病理组织学显示肾小管上皮细胞变性、坏死,单核细胞大量增生;肝细胞颗粒样病变.脾髓质弥漫性出血,皮质区淋巴小结生发中心萎缩.(3)免疫组化结果显示衣原体包涵体主要分布于肾脏近曲小管、远曲小管,以及脾脏的髓质区.(4)PCR检测显示分离株感染后,肾脏、脾脏、肺脏、肝脏中均呈阳性.在卵巢组织中,高剂量组呈阳性.结论 以B10011和CG1分离株人工感染怀孕豚鼠均可导致豚鼠出现流产,且CG1分离株敏感性较高,呈剂量-效应关系;感染豚鼠病理学变化与临床羊流产相似.因此,人工感染豚鼠流产模型可以用于反刍动物嗜流产衣原体病的研究.

APP/PS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析

目的 研究APP/PSI双转基因阿尔茨海默病小鼠模型老年斑形成和行为改变的动态过程.方法 将转APPswe突变基因小鼠与转PS△E9基因突变小鼠杂交,PCR鉴定APPswe/PS△E9双突变转基因小鼠的基因表型,筛选阳性小鼠建立APPswe/PS△E9双转基因C57BL/6J小鼠模型.抗Aβ免疫组化、改良Bieschowsky银染法、Thioflavin-S荧光分别动态检测3、4、5、6、9、12月龄APPswe/PS△E9双转基因小鼠大脑病理改变.荷兰Noldus公司Ethovision XT监测分析软件动态观察3、6、9月龄的APPswe/PS△E9双转基因小鼠Morris水迷宫行为学改变.利用SPSS16.0软件统计分析.结果 建立了人APPswe/PS△E9双转基因阿尔茨海默病小鼠模型.3月龄APP/PSI双转基因小鼠大脑组织抗Aβ1-17免疫组织化学、改良Bieschowsky银染法、Thioflavin-S荧光未检测到有明显老年斑形成.4.5月龄APPswe/PS△E9双转基因小鼠大脑组织上述三种方法均可检测到老年斑.9、12月龄双转基因小鼠老年斑数量体积明显增加,出现与阿尔茨海默病患者较相似的老年斑改变.Morris水迷宫试验发现3、6、9月龄APPswe/PS△E9双转基因小鼠行为学结果与同月龄野生型小鼠有差异,说明与同月龄野生型小鼠相比出现记忆学习能力缺陷(P<0.05).结论 成功建立了人APPswe/PS△E9双转基因小鼠阿尔茨海默病模型,为阿尔茨海默病发病机制研究和药物研发提供了有价值的动物模型.

光化学法制作食蟹猴局部脑缺血模型

目的 使用光化学法构建食蟹猴局部脑缺血模型,为干细胞移植治疗提供必要的条件.方法 选择8只健康成年食蟹猴,静脉注射35 ms/kg体重的玫瑰红B 5 min后用冷光源照射大脑皮层中央前回10 min.第一次注射后10 min钟注射第二次玫瑰红B,浓度与第一次相同.照射完毕后,向颞侧移动光源发光口,在第二点照射10min.利用影像学、神经功能缺损评分和组织病理学对模型进行评价.结果 动物清醒后表现出不同程度的脑缺血症状与体征.病理学检查可见明显的坏死灶.坏死灶周围脑组织水肿,神经细胞变性坏死.结论 成功的将光化学法首次应用于灵长类动物,为进行与临床有重要意义的神经细胞保护研究提供了重要的工具.

中国3种特有小型猪品系脂联素受体1基因外显子5的多态性分析

目的 探讨我国三个特有的小型猪品系-中国农大小型猪,五指山小型猪,广西巴马小型猪脂联素受体1基因多态性分布,为这些小型猪在代谢性疾病和2型糖尿病研究中的应用提供基础资料.方法 提取三个品系小型猪血液基因组DNA,针对脂联素受体1基因外显子5-内含子5的部分序列进行PCR扩增,对产物进行鉴定和测序,分析基因多态性.结果 在所扩增的片段中共检测出5个SNPs--SNP1:G138A,发生在所有的小型猪品系中,并导致第45位的氨基酸由甘氨酸(Gly)转变为谷氨酸(Glu);SNP2:G185A,所有的纯合突变均发生在五指山小型猪品系中(4/6,66.67%),而所有的杂合突变则发生在中国农大小型猪品系中(3/10,30%);SNP3:G200A,全部发生在中国农大小型猪品系中,且均为杂合突变(3/10,30%);SNP4:C295T,发生在广西巴马小型猪品系中的突变既有杂合突变(1/6,16.67%)也有纯合突变(2/6,33.33%),发生在中国农大小型猪品系中的突变全为杂合突变(2/10,20%);SNP5:T337G,只出现在中国农大小型猪品系中,且为杂合突变(1/10,10%).结论 SNP1,在所有测定的小型猪品系中检出,这可能是所测小型猪共有的特性.SNP2,可能是小型猪品系之间的差异.SNP3和SNP4,可能是小型猪品系之间的差异,也可能是个体的差异.SNP5,可能是个体差异.

ELISPOT方法检测SIVmac239感染猴特异性细胞免疫水平

目的 为了完善现有的SIV/恒河猴模型,掌握恒河猴被SIV感染后体内细胞免疫应答状态,为评价HIV疫苗提供方法和数据上的参考,我们测定了SIV感染猴体内病毒特异性的细胞免疫水平.方法 实验前选出4只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,用SIVmac239病毒液静脉感染实验猴,使用RT-PCR、流氏细胞术和ELISPOT等方法,监测SlVmac239病毒在恒河猴体内复制情况、感染猴的外周免疫损伤情况和细胞免疫情况,持续测定一年.结果 实验结果显示IFN-γ ELISPOT方法能有效的评估实验猴的细胞免疫情况,IFN-γ ELISPOT结果和CD4+T细胞数无相关性,与血浆病毒载量稍有相关.结论 本实验明确了SIVmac239感染中国恒河猴体内CTL的基本趋势和范围,了解了外周血病毒载量、外周免疫损伤与细胞免疫状况之间的联系,完善了SIV/SAIDS模型评价指标,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了基础条件.

高致病性禽流感(H5N1)实验流行病学初探——感染途径

目的 观测不同感染途径实验性感染BALB/c小鼠后的感染状况,了解H5N1病毒的感染特点,为更深入的流行病学研究提供理论基础.方法 分别通过口腔接种、污染饲料、腹腔注射、皮肤损伤途径感染6-8周龄BALB/c小鼠,定期安乐动物采血及各器官组织进行血清学、病原学、病理学检查,记录抗体变化、病毒分离情况及病理学改变.结果 各途径感染小鼠感染后出现竖毛、弓背、觅食减少、体重减轻、精神呆滞及神经系统症状,肺组织病毒分离及RT-PCR阳性,病理表现间质性肺炎.感染后第7 d动物血清中可检测到H5N1抗体.结论 通过口腔接种、污染饲料、腹腔注射及皮肤损伤多种途径感染BALB/c小鼠,均能发生感染,提示呼吸道以外的感染方式不容忽视,有益于人类更好的防控禽流感;可通过多种方式建模,深入研究禽流感的发病机制.

《中国比较医学杂志》稿约

实验动物骨髓改良组织病理学评价

骨髓组织病理学评价能够提供关于造血系统和药物相关毒性的重要信息,对于某种损伤的诊断,可以使用很多术语.为了提高评价的一致性,近年来,世界各国药品管理和专业学术机构都非常重视诊断术语的标准化,强调使用描述性的而不是解释性的术语.美国毒性病理学会(STP)推荐的"淋巴器官改良组织病理学评价"方法,其作为能够运用的一种工具来协助毒性病理学工作者辩识评价具有免疫调控作用的药物,具有较高学术价值.文中对骨髓的标本制备,基本形态学特征,改良组织病理学诊断要点以及评价方法进行了归纳和概括性介绍,为相关领域的科研人员提供参考.

猕猴结核分枝杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

目的 建立猕猴结核分枝杆菌PCR快速检测方法.方法 根据GenBank中报道的人型结核分枝杆菌标准株H37RV全基因序列,针对其中致病性结核分枝杆菌所特有的保守区域ESAT-6设计一对引物进行Touchdown PCR反应,利用此方法对100份野生来源猕猴全血标本进行检测,并与传统的PPD实验和咽拭子抗酸染色实验结果作比对.结果 抽取33份野生来源猕猴的外周血,提取DNA进行扩增,扩增片段经纯化、回收克隆测序后用BLAST软件进行同源性对比,与GenBank中报道的序列基本相同,检测标本中有4份(4/33)为阳性,其中3份(3/33)标本与结核菌素试验和咽拭子抗酸染色试验结果相符合.结论 建立了从猴全血中直接检测猴结核分枝杆菌DNA的Touchdown PCR方法,具有敏感性和特异性高,且简便的优点.

非人灵长类动物胃镜检测技术的建立

目的 建立非人灵长类动物胃镜检测技术.方法 复方氯胺酮麻醉动物,将内镜经口腔、咽依次进入食管、胃、十二指肠,观察粘膜状况后在胃、十二指肠分别取材,术后清洗消毒内镜,动物即时苏醒.结果 内镜顺利进入食管、胃及十二指肠,进镜深度分别约10 cm、30 cm、50 cm,各段粘膜光滑平整,未见明显异常.术后动物未发生不良反应及并发症.结论 非人灵长类动物胃镜检测技术的建立,为研究非人灵长类动物上消化道疾病搭建了良好的技术平台.