聚合酶链反应改良技术及其用途
摘要： 80年代中期出现了一种新技术,称为聚合酶链反应(Polymerase chain reation,PCR),其基本原理是在目的基因的两端人工合成两段寡核苷酸引物,在提取于水生嗜热菌中的DNA聚合酶TaqI作用下,以溶液中4种脱氧核苷酸为原料,以待测的目的基因为模板,在人工控制的变性温度、复性温度及延伸温度条件下，于短期内完成目的基因的体外扩增。PCR技术诞生之初基本的用途之一是基因诊断。近随着分子生物学及分子遗传学的进步，针对PCR系统中模板取材、引物设计的改良及PCR产物的不同运用，PCR技术及其用途被多层面、全方位地发展了，从而也显示了PCR技术在生命科学不同领域中运用的强大功能。本文首先就普通PCR技术在各环节的革新方式作一简介，再例举不同PCR改良技术在各研究领域的运用。1 针对PCR技术各环节的革新措施1.1 引物的改良 引物的设计和选择是PCR技术的重要部分，直接关系到PCR的敏感性和特异性，通常需要了解基因背景信息而设计合成引物。随着所合成引物可裁信息量的增加，引物的职能也在不断增加，除了引导脱氧核糖核酸按模板限定聚合外，还可制造出特定的结构以便PCR产物进一步用于基因片段克隆及或基因突变位点的鉴定。如对裂殖子表面蛋白1的17区基因片段（MSP1-17）的PCR扩增，其引物设计时，在正向引物上设计有SalⅠ限制性内切酶位点及起始码，反向引物上设计有BamHⅠ限制性内切酶位点及终止码，由这对引物引导合成的DNA片段属于MSP-17基因，经SalⅠ和BamHⅠ双酶切后的回收片段能与被同样双限制性内切酶切的puc18质粒载体重组［1］。此处的引物的所含的4个功能序列为终得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如，对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶（DHFR）基因进行多态研究时，所用PCR引物F/3′末端以个别碱基替换的机制生成了DraⅠ限制性内切酶位点，通过相应限制性内切酶切后能灵敏地检测出该164号密码子为编码异亮氨基酸多态［2］。又如，为了能直接从PCR扩增产物的指纹图鉴定恶性疟原虫多药抗性基因（Pfmdr1）片段的多态性，使DCW3引物3′末端的碱基以替换方式产生TAT序列，带该3′末端序列的引物只能扩增可与该引物产生全面互补、且含酪氨酸编码序列多态的Pmdr1基因，从而对PCR产物的电泳分析就能鉴别酪氨酸编码的存在［3］。另外，在PCR引物末端带上某种配体，以便PCR通过配体结合机制与别的系统联结，如扩增恶性疟原虫SSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列的引物5′末端结合有生物素，带有生物素的PCR产物与包被在聚乙氯烯板上的亲和素结合,结合体可在荧光素标记的寡核苷酸探针介导下与ELISA系统相接［4］。这种对引物的改良所建立的有PCR参予的系统其敏感性、特异性均高于一般PCR。
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结核分枝杆菌蛋白Rv1813c原核表达、纯化及免疫活性研究
目的 克隆、表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv1813c,分析其免疫活性. 方法 应用生物信息学方法分析Rv1813c蛋白序列,根据H37Rv基因组序列合成引物,PCR扩增Rv1813c基因,克隆至pGEM-T载体;挑取阳性克隆测序,将正确编码基因克隆到pET30a载体上,在大肠埃希菌BL21菌株中以IPTG诱导表达重组蛋白.以金属螯合层析分离纯化重组蛋白,采用ELISA法分析其免疫反应性. 结果 Rv1813c蛋白第34位氨基酸残基之前含有跨膜区及信号肽部分,可能是一个胞外蛋白.对重组质粒pET30a-Rv1813c测序,与设计的序列相同.重组蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式表达,IPTG诱导3h-4h重组蛋白在大肠埃希菌中的表达量较高,表达量约占细菌总蛋白的40％以上.纯化的重组Rv1813c蛋白纯度＞95％.ELISA分析重组Rv1813c蛋白与结核患者血清有较强的反应性,A450值为0.50±0.34,显著高于健康组A450值0.23±0.18及非结核呼吸疾病组A450值0.30±0.27(P＜0.05). 结论 成功构建的结核分枝杆菌重组质粒能高效表达Rv1813c蛋白,该蛋白具有良好的免疫反应性,为结核病的免疫机制研究奠定了基础.
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十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP1的原核表达及其抗凝活性研究
目的 分离、克隆十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP1基因,在大肠埃希菌中重组表达AduNAP1,并检测其抗凝活性. 方法 以十二指肠钩虫成虫cDNA为模板,PCR扩增AduNAP1成熟肽编码序列,并克隆、连接到表达质粒pET32a-sumo,构建原核表达载体pET32a-sumo/AduNAP1.重组载体转入到大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达.重组产物经Ni亲和层析后用SUMO蛋白酶酶切融合伴侣,纯化获得重组目的多肽.用 SDS-PAGE分析蛋白表达及纯化情况,用凝血时间法(PT及aPTT)检测重组多肽的抗凝活性. 结果 扩增并克隆AduNAP1成熟肽编码序列,构建的原核表达载体pET32a-sumo/AduNAP-1转化大肠埃希菌表达rAduNAP1.纯化的rAduNAP1能延长PT及aPTT,但延长PT作用更为显著,其延长2倍PT及aPTT时间所需的浓度分别约为142 nmol/L及406 nmol/L. 结论 构建rAduNAP1表达载体,其表达产物具有较强抗凝活性,为进一步了解AduNAP1的生物学功能及作为抗凝新药开发应用奠定了基础.
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乳源致病性金黄葡萄球菌原生质体膜表而蛋白nEBPS的亚细胞定位研究
目的 克隆牛乳源致病性金黄葡萄球菌nEBPS基因,经T程菌表达得到其编码抗原纯化蛋白,制备多克隆抗体,采用间接荧光抗体法鉴定nEBPS蛋白. 方法 设计1对克隆引物,PCR扩增牛乳腺炎金黄葡萄球菌内蒙古分离株EBPS基因序列,构建重组表达质粒,转化工程菌,表达膜表面亚单位蛋白nEBPS,纯化后免疫家兔制备抗nEBPS蛋白抗体,采用间接荧光抗体法对乳源致病性金黄葡萄球菌原生质体膜表面蛋白nEBPS进行亚细胞定位. 结果 在含25 μg/ml Amp、0.015 g/ml NaCl的LB液体培养基中成功培养制备了金黄葡萄球菌原生质体.对原生质体细胞(表面)和利用0.02 g/ml NaCl高渗溶液裂解原生质体细胞离心获得的细胞膜残片进行间接荧光抗体试验,均出现特异荧光.结论 间接荧光抗体试验鉴定nEBPS蛋白为膜表面蛋白,可作为乳及乳制品金黄葡萄球菌检测和制备免疫制剂的靶抗原.
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白头翁提取物体外抗猪三毛滴虫作用研究
目的 探讨白头翁4种提取物对猪三毛滴虫的杀灭效果,为临床用药提供依据. 方法 利用不同浓度白头翁4种提取物进行体外抗猪三毛滴虫试验,绘制虫体生长曲线,分析猪三毛滴虫对白头翁4种提取物的敏感性. 结果 白头翁4种提取物在0.312 5～5.0 mg/ml浓度时均具有抑制或杀灭猪三毛滴虫的作用,且作用效果随着药物浓度的增加而增强.白头翁4种提取物抑杀猪三毛滴虫效果水浸膏＞乙酸乙酯＞正丁醇＞皂苷. 结论 白头翁水浸膏和乙酸乙酯成分具有较强的抗猪三毛滴虫作用.
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小发夹RNA体外抑制乙型肝炎病毒X蛋白表达的实验研究
目的 构建靶向乙型肝炎病毒X基因(HBX)的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,观察其体外抑制HBX在HepG2细胞中表达的作用,为应用RNA干扰技术进一步研究HBX基因的功能奠定基础.方法 设计并构建靶向HBX的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3.1-HBX与pSilencer3.1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72 h后以RT-PCR检测HBX基因表达情况,以Western blot检测HBX蛋白的表达量.结果 经酶切和测序鉴定,构建的重组质粒pSilencer3.1-shHBX与设计一致.该质粒使HBX基因mRNA表达量降低47.1%,使HBx蛋白表达量降低58.9%,而阴性对照质粒无此作用.结论 成功构建靶向HBX shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,该质粒可体外抑制HBX在HepG2细胞中的表达.
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粉螨性小鼠哮喘模型的建立与评估
目的 探讨采用椭圆食粉螨提取浸液建立C57BL/6小鼠哮喘模型的方法. 方法 45只C57BL/6小鼠随机分成3组:PBS阴性对照组、卵清蛋白(OVA)阳性对照组、椭圆食粉螨(Ale o)哮喘模型组.用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)、脾细胞培养上清液中IL-4、IL-17和IFN-γ的含量,计数BALF中细胞总数并分类,同时切取小鼠未灌洗侧肺组织进行病理学观察. 结果 OVA阳性对照组、Ale o模型组小鼠脾细胞上清和BAILF中IL-4、IL-17及IFN-γ含量与PBS阴性对照组相比,差异均具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；OVA阳性对照组、Ale o模型组小鼠BALF中细胞总数及各类细胞数与PBS阴性对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；小鼠未灌洗侧肺组织病理学观察显示,OVA阳性对照组和Ale o模型组小鼠肺组织口见大量炎症细胞浸润,以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞为主. 结论 用椭圆食粉螨提取浸液建立的C57BL/6小鼠哮喘模型具有过敏性哮喘的主要特征.
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血清胱抑素C在肾脏疾病诊断中的临床应用
目的 探讨血清胱抑素C(CysC)在肾脏疾病诊断中的临床价值.方法 将354例肾病患者按肾脏损伤程度分为4组,检测血清BUN、Scr、UA和CysC并进行对比分析,同时比较BUN、Scr、UA、CysC之间的相关性及敏感性.试验设104例健康对照.结果 肾功能基本正常组与健康对照组比较CysC差异有统计学意义(P＜0.05);随着肾脏损伤程度的加重,BUN、Scr、UA、CysC均显著升高,组间差异有统计学意义(P＜0.05);4指标异常率与肾损伤程度呈正相关,其中CysC r=0.979.肾功能轻度异常组Scr异常率低(37.2%),肾功能重度异常组UA异常率低(72.9%).结论 CysC是肾功能早期损害的灵敏诊断指标,CysC和BUN可用于评价肾脏疾病的进展和判断预后,Scr在轻度肾损伤时不敏感,UA不能单独作为评价肾脏疾病的进展和判断预后的指标.
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pEGFP-C2-hTim-3真核表达载体的构建和hTim-3质粒稳定转染16HBE细胞株的建立
目的 筛选表达Tim-3的人呼吸道相关细胞株,为进一步阐明Tim-3可能与人呼吸道疾病相关奠定基础;构建pEGFP-C2-hTim-3真核表达载体,以期用于hTim-3的功能研究.将测序正确的重组质粒pEGFP-C2-hTim-3转染入人支气管上皮细胞株16HBE中,筛选出阳性细胞克隆,为后续实验提供理论基础. 方法 用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃5％CO2饱和湿度培养箱中体外培养人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82,调整细胞到佳状态,对数生长期时收集细胞,抽提总RNA,逆转录为cDNA.参照人GenBank中Tim-3基因的全长序列,使用Primer5.0设计并合成其引物,采用PCR检测以上3种细胞Tim-3的mRNA.将健康人外周血Tim-3基因全长cDNA片段克隆入真核表达载体pEGFP-C2,经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,构建包含目的基因Tim-3的重组质粒pEGFP-C2-hTim-3.利用脂质体介导pEGFP-C2-hTim-3质粒和pEGFP-C2质粒分别转染16HBE细胞,荧光显微镜下观察16HBE细胞的瞬时转染效率,并采用含G418的培养基筛选以获得整合pEGFP-C2-hTim-3和pEGFP-C2的阳性细胞克隆,用荧光显微镜观察pEGFP-C2-hTim-3和pEGFP-C2在16HBE细胞上的定位表达. 结果 1)PCR显示人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82均表达Tim-3 mRNA;2)构建了具有筛选特征和能够稳定表达的pEGFP-C2-hTim-3质粒载体,测序结果与预期设计完全一致;3)瞬时转染后经荧光显微镜检查可见表达pEGFP-C2-hTim-3绿色荧光蛋白的16HBE细胞不足8％,表达pEGFP-C2绿色荧光蛋白的16HBE细胞不足15％o.采用G418筛选后获得表达野生型hTim-3和外源性pEGFP-C2-hTim-3的16HBE细胞及转染pEGFP-C2空质粒的16HBE细胞,经荧光显微镜观察前者定位在胞膜上,后者定位于胞质中. 结论 人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82均表达Tim-3 mRNA,Tim-3可能与人类呼吸道疾病的发生和发展相关.成功构建了真核表达载体pEGFP-C2-hTim-3并获得了高表达pEG-FP-C2-hTim-3的16HBE阳性克隆细胞,可供后续研究使用.
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进食对家蝇成虫肠道共生细菌组成和数量的影响
目的 了解进食对家蝇成虫肠道共生菌数量和种类的影响. 方法 刚羽化的家蝇随机分为正常喂食组和未喂食组,每天分雌、雄取样,解剖肠道后,分离其肠道内细菌,直到全部死亡.家蝇肠道共生细菌采用传统方法分离培养.挑取形态有差异的单菌落,于LB培养基中摇菌过夜,提取DNA,进行16s rDNA基因扩增,扩增产物测序,并在NCBI中进行序列比对,鉴定到属,计数家蝇不同虫态肠道中分离到的细菌菌属数,分析其变化. 结果 在家蝇成蝇肠道内共分离到共生菌17属,其中正常进食成蝇分离到12属,未进食成蝇肠离到10属,两组共有细菌6属,分别为普罗威登斯菌属、葡萄球菌属、香味菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属和不动杆菌属.正常喂食的家蝇肠道中特有的细菌有7属,分别为苍白杆菌属、鞘氨醇杆菌属、肠球菌属、寡养单胞菌属、土壤杆菌、代尔夫特菌属和漫游球菌属;未喂食家蝇肠道中特有的细菌有4属,分别为白色杆菌属、肠杆菌属、短状杆菌属和微杆菌属.正常喂食组不同日龄雌虫和雄虫肠道中分离到的共生细菌菌属数量差异有统计学意义(F值分别为5.57和3.57,P＜0.05或P＜0.01);未进食组不同日龄雌虫和雄虫肠道中分离到的共生细菌菌属数量差异无统计学意义(F值分别为0.17和0.92,P＞0.05). 结论 进食不但可影响家蝇的寿命,还可影响家蝇成虫体内的肠道共生细菌的组成,推测其肠道共生细菌可能部分来自于食物和生活环境.
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蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因的克隆分析与原核表达
目的 克隆并表达蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12.方法 根据家蚕微孢子虫基因组数据库信息设计简并引物进行PCR扩增,克隆得到蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因.利用生物信息学软件对NpSWP12的基因与蛋白序列进行分析与结构功能预测.将该蛋白基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,转化表达载体至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE与Western blot检测.结果 蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因长687bp,编码228个氨基酸残基(基因登录号:KT287071),预测蛋白质分子质量单位为26.6ku,等电点(pI)为5.96.蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因结构为单外显子结构,编码的蛋白中α螺旋占77.19％.该编码蛋白含有1个BAR结构域(Bin/Aphiphysin/Rvs domain),属BAR结构域蛋白质超家族成员.NpSWP12与家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP12核苷酸序列序列相似性为95.2％,氨基酸序列相似性为96.9％.表达载体NpSWP12/pET-30a(+)转入BL21 (DE3)菌株,IPTG诱导,得到的重组蛋白rNpSWP12与理论蛋白分子质量大小(30ku)相符.Western blot鉴定.结论 成功克隆了蓖麻蚕微孢子虫孢壁蛋白NpSWP12基因,构建的NpSWP12/pET-30a(+)重组原核表达载体表达预期分子质量的融合蛋白,该蛋白能被相应抗体识别,为进一步研究NpSWP12的细胞定位和功能奠定了基础.
