APS IgG通过非Fc受体途径诱导血液单核细胞表达TF活性

目的:探讨抗磷脂综合征(Antiphospholipid Syndrome,APS)患者血清IgG体外诱导血液单核细胞表达组织因子(Tissue Factor,TF)活性的作用及其作用途径.方法:利用纯化的APS血清IgG及其F(ab')2片段,以及抗磷脂结合蛋白(如β2 glucoproteinⅠ,β2 GPI)单克隆抗体RP-1分别刺激新鲜分离的外周血单核细胞,通过因子Xa的生成量,判断单核细胞TF活性的表达.结果:与健康人血清IgG比较,APS患者血清IgG以及RP-1显著增强单核细胞的TF活性;外源性β2GPI可加强APS IgG的这一诱导作用;从APS IgG中纯化出的F(ab)'2片段具有与完整IgG分子相同的刺激效应.结论:抗磷脂抗体,主要为抗β2GPI,以与抗原特异结合方式,通过非Fc受体途径诱导血液单核细胞表达TF活性,成为APS患者血栓形成的机理之一.

人血管抑制因子的原核表达、纯化及活性研究

目的:利用大肠杆菌表达系统表达人血管抑制因子,并利用镍金属螯合层析法进行纯化,探讨其抑制血管内皮细胞增殖的活性.方法:采用RT-PCR技术从人肝脏组织中获取人血管抑制因子的 cDNA,将其克隆至原核表达载体pQE30中进行IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE分析,并利用镍金属螯合层析法进行纯化.3H-TdR法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果:利用pQE30表达载体表达的含6个组氨酸尾的vasostatin蛋白,在SDS-PAGE上表现出一条约21 kD的阳性条带,经镍金属螯合层析纯化后的蛋白经肽指纹图谱分析鉴定为目的蛋白,在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖.结论:人血管抑制因子可在大肠杆菌中以包涵体形式高水平表达,并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性.

中性粒细胞小GTP结合蛋白的表达与冠心病发生关系的研究

目的:探讨中性粒细胞活性氧的产生及小GTP结合蛋白Rac2和RhoGDI的差异性表达在冠心病(GHD)发生发展中的作用.方法:采用化学发光法检测活性氧,适时定量RT-PCR检测调控中性粒细胞活性氧产生的两种小GTP结合蛋白Rac2和RhoGDI mRNA表达量的变化.结果:冠心病组中性粒细胞产生活性氧显著增多,冠心病人血清中各种炎性因子有促进中性粒细胞产生活性氧的作用;Rac2mRNA在冠心病组表达量显著性高于正常对照组,而RhoGDI mRNA的表达量在两组中无显著区别,Rac2mRNA和RhoGDImRNA表达量的比值与中性粒细胞产生活性氧的峰值呈正相关.结论:中性粒细胞通过产生活性氧参与冠心病的发生发展,冠心病病人中性粒细胞Rac2和RhoGDI mRNA表达量比例失调是导致活性氧产生增多的重要因素.

去唾液酸糖蛋白受体与慢性肝病自身免疫

去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein Receptor ,ASGPR)是肝细胞的一种重要且高效的内吞受体,主要分布于肝小叶门静脉周围肝细胞的窦面膜上,又名肝凝集素(liver lectin).近年来研究发现该受体除了在肝脏基因定向转移、靶向药物治疗当中具有较高的应用价值之外,还相继在自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、病毒性肝炎等慢性肝病患者血清中检测到其相应的自身抗体,从这些患者外周血、肝活检组织分离到ASGPR特异性的T淋巴细胞.由于ASGPR的肝脏特异性与其在肝脏的特殊分布位置和某些慢性肝病的组织病理学特征极为吻合,从而激起了人们探讨ASGPR与慢性肝病自身免疫关系的兴趣.

共刺激分子4-1BB及其配体4-1BB Ligand(4-1BBL)与肿瘤免疫

1970年Bretscher和Cohn首先提出"T细胞激活双信号"假说以来,细胞免疫"双信号"学说得到大量的体外实验的证实[1].介导共刺激信号的分子有多种,4-1BB与4-1BBL是其中非常重要的一个成员.4-1BB/4-1BBL介导的共刺激信号可以诱导T细胞的活化、增殖及抗凋亡,维持T细胞的长期生存及提高细胞因子的分泌,4-1BB还能通过CD28非常依赖途径刺激T细胞的增殖并在树突状细胞和单核细胞介导的细胞免疫中起作用.因此,4-1BB和其配体4-1BBL介导的共刺激信号是激发有效的抗肿瘤细胞免疫应答尤其是长期抗肿瘤效应所必需的,有望为肿瘤生物治疗开拓新的途径.

阻断CD40-CD40L共刺激途径对T细胞表型及细胞因子分泌的作用研究

目的:探讨应用抗CD40L单克隆抗体阻断CD40-CD40L共刺激途径后对T细胞表型及其分泌的细胞因子的影响,为体外阻断该共刺激途径诱导T细胞对异体移植抗原的免疫耐受提供实验依据.方法:供鼠(C57BL/6H-2b)脾T细胞作为反应细胞,受鼠(BALB/CH-2d)脾细胞作为刺激细胞,设单抗组(加抗CD40L单抗)和对照组(不加单抗),初次混合淋巴细胞培养(MLR)7天,在不同时间点采用3H-TdR掺入法检测细胞增殖率,以ELISA法测定培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等的水平,第5天采用流式细胞仪检测CD4+T和CD8+T细胞上CD25、CD69、CD40L和CD45RA的表达.再次MLR 5天,第1、3、5天采用3H-TdR掺入法测定细胞的增殖情况和ELISA法测定培养上清液中的上述细胞因子的水平.结果:初次和再次MLR结果均显示,单抗组细胞增殖反应率明显低于对照组.初次MLR单抗组中CD4+T和CD8+T细胞比例明显低于对照组(P＜0.05);单抗组中CD4+CD25+T、CD4+CD69+T、CD8+CD25+T、 CD4+CD40L+T和CD8+CD69+T细胞比例明显低于对照组(P＜0.05),而CD8+CD40L+T和CD4+CD45RA+T细胞的比例与对照组相比无明显差异(P＞0.05).初次MLR中单抗组和对照组培养上清中IL-4和IL-10几乎无法测出,而单抗组培养上清中IFN-γ和IL-2的水平均明显低于对照组(P＜0.01);再次MLR后培养上清中单抗组IFN-γ、IL-2和IL-4和IL-10的分泌水平明显低于对照组(P＜0.05),但处于低水平,仍明显低于对照组.结论:在体外MLR体系中,应用抗CD40L单抗孵育供鼠脾T细胞,可同时作用于CD4+T和CD8+T细胞,使CD40L+,CD25+和CD69+表达下降,引起T细胞早期的活化和成熟障碍,T细胞增殖能力减低,抑制了Th1类细胞因子IFN-γ和IL-2及Th2类细胞因子IL-4和IL-10的分泌水平,可诱导供者T细胞免疫耐受.

hIL-10修饰树突状细胞对实验动物淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响

目的:探讨hIL-10修饰DC对实验动物免疫功能的影响.方法:将经hIL-10基因修饰或未修饰DC腹腔注射C57BL/6致敏小鼠,以致敏或未致敏C57BL/6单个核细胞作为反应细胞,以未修饰DC细胞及修饰DC为刺激细胞,共培养6天,MTT检测细胞增殖,乳酸脱氢酶法测定细胞毒活性.结果:hIL-10对未修饰DC致敏或未致敏小鼠的同种细胞刺激的增殖反应有明显的抑制作用.hIL-10修饰DC诱导不同组小鼠淋巴细胞增殖反应显著低于未修饰DC细胞诱导小鼠淋巴细胞增殖反应, hIL-10修饰DC对不同组小鼠CTL细胞毒活性具有抵抗作用.结论:hIL-10修饰的DC诱导同种小鼠淋巴细胞的增殖反应显著降低和对CTL胞毒活性抵抗.

结核杆菌抗原特异性激发人γδT细胞活化信号涉及Ras/Erk途径

目的:探讨Ras/Erk通路是否参与结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)启动的γδT细胞活化信号转导途径.方法:分离获取PBMC,用佛波醇酯(PMA)和离子霉素(IM),CD3mAb或Mtb-Ag刺激不同时间,或PBMC先经PD98059处理后再刺激培养;用荧光单抗染色后在流式细胞仪测定细胞CD69分子的表达;计数培养扩增10天的细胞数量.结果:PBMC用PMA+IM刺激6小时,总T细胞和γδT细胞中的CD69表达均达高峰(均＞99%),用CD3mAb刺激24小时,均达高峰(均在55%左右),用Mtb-Ag刺激24小时,亦均达高峰,但总T细胞和γδT细胞中CD69分别为16.0%和75.2%;用PD98059预处理PBMC,可明显抑制Mtb-Ag激活的γδT细胞CD69表达和γδT细胞的增殖.结论:Mtb-Ag可特异性激活γδT细胞,其活化信号转导需通过Ras/Erk通路.

树突状细胞与永生化EBV转化B淋巴细胞对抗原提呈作用的比较分析

树突状细胞是抗原提呈功能强的专职性抗原提呈细胞,其显著特征是刺激初始性淋巴细胞增殖,而EBV转化B淋巴母细胞是提呈作用较B细胞强的永生化细胞,可通过对自体淋巴细胞的刺激作用以及负载抗原后刺激活性的变化,来比较这两类细胞的生物学特性.本研究比较了二者对肝癌抗原的提呈作用.

EB病毒蛋白对免疫球蛋白产生的调节作用

目的:检验EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)蛋白对培养的人B细胞产生免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)的影响.方法:用UV灭活和热处理的EBV刺激培养的人脐带血B细胞,流式细胞仪检测UV灭活EBV组细胞CD5、CD3、CD4和CD8的表达,ELISA法检测培养上清中IgG和IgM,同时与EBV转化B细胞产生的IgG和IgM 作对比.结果:第14天未检测到T细胞,CD5+B 细胞占43%;28天时CD5+B细胞占47%.UV灭活EBV组:第10、18、22和26天IgG A值与对照组相比有显著差异(P＜0.05),第10天以后各时间点IgM A值与对照组相比有显著差异(P＜0.05).EBV转化培养B细胞40天,IgG和IgM A值与同期其它各组有显著差异(P＜0.05).结论:EBV蛋白有诱导Ig产生的作用.

人TRAIL分子胞外区的纯化及活性检测

目的:利用大肠杆菌表达hTRAIL41～281蛋白,并纯化复性成生物活性形式.方法:以IPTG诱导表达,使用Ni-NTA层析柱分离纯化蛋白,透析法复性,SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定,DNA断裂实验检测hTRAIL41～281蛋白的凋亡诱导活性.结果:表达的蛋白以包涵体的形式存在,纯化后得到分子量为30.5 kD、纯度在90%以上的蛋白,Western blot 证实为hTRAIL41～281分子.经复性,DNA 断裂实验检测出该蛋白有较好的诱导肿瘤细胞凋亡活性.结论:成功地利用大肠杆菌表达、Ni-NTA层析柱分离纯化、透析法复性hTRAIL41～281蛋白,并证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性.

CCR5 mRNA的实时RT-PCR定量检测

CCR5是位于人细胞表面与β-趋化因子MIP-1α、MIP-1β、RANTES结合的受体,属于七跨膜区受体超家族的G蛋白偶联受体[1].它不仅在HIV的感染过程中作为HIV的辅助受体,介导HIV进入宿主细胞,而且趋化因子作为功能性的小蛋白分子,与淋巴细胞的体内迁移和归巢、造血细胞的生成、胚胎的正常发育、炎症性疾病、肿瘤的生长等功能密切相关[2].因此精确检测CCR5的表达,不仅对临床医学而且对基础医学研究都具有重要意义.

流式细胞术外周血样品的直标法

流式细胞术(FCM)以其快速、简便、准确的检测和分析而广泛应用于细胞生物学、肿瘤学、免疫学等领域,特别是多种识别白细胞抗原的单克隆抗体的出现,使FCM在外周血白细胞分析的基础研究和临床诊断中得到了广泛应用[1].因而优化一种快速、简便、准确的外周血白细胞的FCM免疫荧光标记法显得尤为重要.我们通过对3种直接荧光标记法的比较及其样品用血量的探讨,旨在建立一种用于FCM的佳直接荧光标记法.

瑞香狼毒甲醇提取物抗瘤免疫机理初探

有报道瑞香狼毒复方或提取物用于恶性肿瘤治疗有一定疗效[1-3],但有关其抗瘤免疫机理研究资料较少.本文用瑞香狼毒甲醇提取物,在体内外对其抗瘤免疫机理进行了初步探讨.

抗原NY-BR-1的HLA-A2限制性CTL表位的初步鉴定

目的:鉴定乳腺癌分化肿瘤抗原NY-BR-1的HLA-A2限制性CTL表位.方法:采用量化基序法初步预测NY-BR-1的HLA-A2限制性CTL表位;分子动力学方法进一步筛选量化基序法中评分高的3个表位肽;HLA-A2亲合力鉴定预测的结果.结果:分子动力学和HLA-A2亲合力实验均证明,在量化基序法预测的3个候选CTL表位中,NY-BR-11043-1051与HLA-A2亲合力佳.结论:NY-BR-11043-1051可能为乳腺癌分化抗原NY-BR-1的HLA-A2限制性CTL表位.

清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠炎症细胞因子的影响

目的:观察清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠细胞因子含量的影响.方法:采用弗氏完全佐剂性制备大鼠佐剂性关节炎模型,观察清络通痹颗粒对佐剂性关节炎大鼠IL-1、TNF-α的影响.结果:清络通痹颗粒[7.2,14.4 g/(kg*d).ig]能明显降低佐剂性关节炎大鼠IL-1、TNF-α水平.结论:清络通痹颗粒具有抑制佐剂性关节炎大鼠细胞因子异常产生的作用.

麻风病患者治愈后血清sIL-2R和TNFα的研究

目的:研究麻风病病人治愈后免疫功能和细胞因子可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的潜在作用及调节异常,进一步探讨麻风病的免疫发病机理.方法:对浙江省兰溪地区62例麻风病治愈者及其28例直系亲属的血清sIL-2R和TNFα进行检测,并以当地正常人作对照.结果:各型麻风病治愈者血清TNFα和多菌型(MB)治愈者sIL-2R水平均明显降低(P＜0.001和P＜0.002),其中以瘤型麻风病(LL)治愈者TNFα和sIL-2R水平降低显著(P＜0.001和P＜0.005),而少菌型(PB)治愈者sIL-2R与对照组无差异(P＞0.05).结论:提示麻风病病人治愈后仍有细胞因子表达异常和单核巨噬细胞功能障碍,以及MB治愈者T细胞活化功能受抑制.这种血清TNFα和sIL-2R水平低下的持续存在,可能在麻风病病人对麻风杆菌的易感性及对麻风杆菌特异性细胞免疫缺陷的免疫发病中起重要作用.

妊娠特异性β1糖蛋白SRID试剂盒的制备和应用

妊娠特异性β1 糖蛋白(Pregnancy Specific β1 Glycoprotein,SP1或PS β1 G),是胎盘合体滋养层细胞分泌的一种特异性蛋白质,在早孕6～8周的妇女中97.4%和孕晚期妇女中100%可检测出SP1,而不存在于正常非孕妇女和男性血中[1].1971年德国Bohn首次从人胎盘中分离出SP1,引起各国学者的重视,现认为检测孕妇血清中SP1的存在及其水平,可作为诊断早孕,检查胎盘功能,判定胎儿预后的一项可信指标.由于SP1在妊娠晚期含量较高,应用单向免疫扩散法(Single Radial Immune Diffusion,SRID),能够定量的测定SP1含量.其操作简单,适合各实验室开展,现将试剂盒的制备及应用报道如下.

干预CD86协同刺激信号诱导母-胎界面Th2型免疫偏离及其对妊娠预后的影响

目的:探讨干预CD86协同刺激信号在母-胎界面Th1/Th2型细胞因子表达调控及诱导母-胎免疫耐受中的作用.方法:将正常妊娠模型CBA×BALB/C和自然流产模型CBA×DBA/2的CBA孕鼠均分为3组:对照组于孕第4、6、8、10天腹腔注射大鼠IgG;A组于孕第4、6、8、10天腹腔注射大鼠抗小鼠CD86mAb;B组仅于孕第4天(着床期)腹腔注射大鼠抗小鼠CD86mAb.孕第9天,竞争性半定量RT-PCR测定各组母-胎界面Th1/Th2型细胞因子转录水平;孕第9、14天ELISA测定母-胎界面组织培养上清IL-4/IFN-γ比值;孕第14天比较两种模型各组的胚胎吸收率R.结果:正常妊娠模型中,干预CD86协同刺激信号对母胎界面原有Th2型免疫偏离及妊娠预后均无显著影响.自然流产模型中,干预CD86协同刺激信号能够诱导母胎界面局部形成Th2型免疫偏离并显著改善其妊娠预后.结论:于孕早期干预CD86协同刺激信号能够恢复母-胎界面局部Th1型/Th2型细胞因子表达的生理平衡,形成维持正常妊娠所需的Th2型免疫偏离,诱导母-胎免疫耐受.

一代宗师的风采