人骨髓间充质干细胞体外分离培养及向血管内皮样细胞分化的研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外分离培养方法及在特定微环境下分化为血管内皮样细胞的潜能,可能为银屑病研究提供实验基础.方法:密度梯度离心法结合贴壁法分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),体外扩增培养并进行鉴定.加入血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导hMSCs向血管内皮细胞分化,流式细胞仪进行细胞表型鉴定,Dil-ac-LDL摄取实验鉴定血管内皮细胞功能.结果:经流式细胞仪测定分离培养的hMSCs CD71、CD44阳性表达,CD54、CDl06、CD45弱阳性表达,CD34、CD31、VWF、KDR、HLA-DR阴性表达;经bFGF、VEGF诱导后的hMSCs可见类似内皮细胞样改变,经流式细胞术检测,与对照组相比内皮细胞特异表面标志CD34、CD31、VWF、KDR表达转为阳性(P＜0.01),而HLA-DR、CD54、CDl06、CD45表达明显上调(P＜0.01);诱导分化后的内皮样细胞具有摄取Dil-ac-LDL的能力.结论:密度梯度离心法结合贴壁法可获得较纯的MSCs;在bFGF、VEGF诱导作用下,hMSCs具有向内皮细胞分化潜能,产生功能性内皮细胞.

CD4~+CD25~+FoXP3~+调节性T细胞及其亚型在结直肠癌组织中分布和临床意义的研究

目的:探讨CD4~+Cff25~+FOXP3~+调节性T细胞(Treg)及其亚型在结直肠癌组织(colorectal carcinoma,CRC)的分布和临床病理特征的关系.方法:收集42例CRC新鲜手术标本,应用冰冻切片、免疫组织化学SP法检测肿瘤组织和癌旁组织中FOXP3~+阳性细胞数,分析其与临床病理特征的相关性;应用双重免疫组化检测FOXP3和ICOS表达,分析FOXP3~+ICOS~+Treg和FOXP3~+ICOS-Treg两种细胞亚型分布情况.结果:CRC患者肿瘤组织中FOXP3分布显著多于癌旁组织,差异显著(P＜0.001);中低分化组Treg细胞数明显高于高分化组(P＜0.01);淋巴结转移组Treg细胞数明显高于无淋巴结转移组(P＜0.05);无远处转移组Treg细胞数明显高于有远处转移组(P＜0.05);FOXP3+ICOS+Treg细胞亚群在CRC组织中高表达,与癌旁组织相比差异显著(P＜0.01).结论:CRC的发生发展与其癌组织局部微环境中Treg数量变化相关,Treg在CRC组织过量表达可能是导致肿瘤免疫逃逸的重要因素之一;抑制CRC微环境中浸润性Treg细胞功能可提高肿瘤局部免疫治疗效果.

现代系统免疫学的形成与发展

现代免疫学通过还原法已弄清人与动物机体都有完整的防御系统,统称免疫系统.动物越是高等,其免疫系统分工越是精细,防御能力越强.

人脐带间充质干细胞的特征及其临床应用前景

1966年间充质干细胞首先由Friedenstein[1]从骨髓中发现,传统理论认为这群细胞在特定诱导条件下可向中胚层细胞即骨、软骨和脂肪细胞分化.

NK-92细胞的研究和应用进展

恶性肿瘤是危害人类生命与健康的较为严重的常见病、多发病.针对肿瘤的治疗方法有多种,其中,肿瘤生物治疗中较成熟的是免疫细胞治疗,尤以树突状细胞(DC细胞)和过继性细胞(CIK细胞、LAK细胞、ANK细胞)治疗效果为好[1].

禽巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的免疫效果

目的:研究禽多杀性巴氏杆菌omph DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫保护效果.方法:利用PCR技术扩增出禽多杀性巴氏杆菌的omph基因片段,克隆到pMD18-T上,再亚克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pOMPH,体外转染SP2/0细胞,RT-PCR、间接免疫荧光试验、Western blot检测其转录及表达情况.然后进行动物免疫,实验动物分为三组即:pOMPH组、pCDNA3.1(+)空载体组和PBS对照组,每组16只BALB/c小鼠,pOMeU组和pCDNA3.1(+)组以100μg/只的剂量肌注免疫,PBS组每只小鼠肌注100μ1×PBS,各组均进行了三次免疫,每次间隔两周.间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,三免两周后检测脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况.强毒攻击,计算小鼠存活数目及保护率.结果:间接免疫荧光试验、Western blot和RT-PCR检测结果均表明pOMPH可在体外培养的SP2/0细胞中表达目的蛋白.动物免疫后,pOMPH组免疫小鼠血清抗体水平持续上升,与pCDNA3.1(+)组和PBS组相比差异极显著(P＜0.01).经提取的外膜蛋白(Omps)刺激后,pOMPH组的刺激值(SI值)与pCDNA3.1(+)组及PBS免疫组相比均差异显著(P＜0.05).免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ极显著高于两对照组产生的IFN-γ(P＜0.01).攻毒后pOMPH组保护率明显高于两对照组,可达70%.结论:成功构建了禽多杀性巴氏杆菌omph DNA疫苗,该疫苗可诱导免疫小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答及较好的保护效果.

抗人DR5功能性单克隆抗体诱导Jurkat细胞凋亡的线粒体途径的分子机制

目的:探讨抗人死亡受体5(DRS)功能性单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞诱导凋亡的线粒体途径的分子机制.方法:MTT法检测单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞生长抑制作用的剂量-效果及时间-效果关系;JC-1单染流式细胞术定量分析技术对凋亡的Jurkat细胞线粒体膜电位的变化进行分析;免疫印迹技术检测凋亡细胞的Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c等凋亡相关蛋白的表达情况.结果:mDRA-6对Jurkat细胞抑制具有明显剂量-效果和时间-效果关系;流式细胞仪检测显示,2.0μg,/ml浓度的mDRA-6作用15、30、60和120分钟时,Jurkat细胞线粒体膜电位改变率分别为20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,呈逐渐增高趋势.免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用后,Jurkat细胞Caspase-8、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c等表达活性增加,并且Cyto C在线粒体内为递减而在胞浆呈递增的表达现象.结论:mDRA-6通过激活外源性膜受体,继而启动细胞线粒体途径导致Jurkat细胞凋亡.本研究为mDRA-6对白血病治疗奠定实验基础.

两株鼠抗人VSIG4单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究

目的:制备鼠抗人vSIG4分子单克隆抗体(mAb)及对其生物学特性进行鉴定.方法:以高表达膜型VSIG4分子的基因转染细胞L929/VSIC4L为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经流式细胞术检测和多次;隆化培养,筛选出特异分泌鼠抗人VSIG4分子的杂交瘤细胞株;采用间接免疫荧光法、western blot、竞争抑制试验及MTT增殖试验等单对抗的生物学特征进行鉴定.结果:获得2株持续、稳定分泌鼠抗人VSIG4 mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为9A7和9D5.对mAb生物学特性的研究结果表明,2株mAb均能识别巨噬细胞以及jurkat、THP-1、H446等肿瘤细胞株表面的VSIG4分子.对T细胞增殖抑制的阻断实验显示,这2株抗体对VSIG4分子抑制T细胞增殖均有阻断作用.结论:成功地获得了2株鼠抗人VSIG4功能性mAb,为进一步研究VSIG4及其未知受体的生物学功能奠定了基础.

应用抑制消减杂交技术构建结核分枝杆菌差异表达基因消减cDNA文库

目的:构建结核分枝杆菌H37Rv与H37Ra的差异表达基因消减文库,分离结核分枝杆菌差异表达cDNA片段.方法:利用抑制性消减杂交技术分析结核分枝杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra的基因组mRNA的表达差异,并进行两轮消减杂交和两次PCR,将第二次PCR产物与pGEM-T载体相连,电击转化大肠杆菌E.coff DH5α进行文库扩增和蓝白斑筛选,RT-PCR承鉴定差异表达文库.结果:以结核分枝杆菌强毒株H37Rv的cDNA为检测子的正相杂交和以弱毒株H37Ra的cDNA为检测子的反相杂交各自高表达或特异性表达的片段都得到选择性扩增,成功构建了差异表达cDNA文库 A库和B库.所长出的菌落中90%为白色克隆,其中单一条带的克隆占75%和80%,片段大小集中在100～800 bp之间.结论:利用SSH技术成功构建了结核分枝杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra差异表达基因消减cDNA文库,该消减文库的建立为进一步筛选、克隆这两种菌株之间差异表达的新基因奠定了基础.

卵巢癌患者一线化疗后CD8~+T细胞和NK细胞数量及功能动态变化的研究

目的:研究晚期卵巢癌患者经一线化疗后体内CD8+T细胞和NK细胞数量及功能的动态变化.方法:选取术后行紫杉醇联合卡铂化疗的晚期卵巢上皮癌患者共13例,采集化疗前(S_0)、化疗后5-7天(S_1)、化疗后12～14天(S_2)和化疗后25～28天(S_3)外周血,流式细胞术检测患者外周血中CD3~+、CD4~+、CD8~+和NK细胞的百分比及绝对数量.采用体外自体肿瘤细胞裂解物脉冲淋巴细胞共培养的方法检测不同时间点CD8~+T细胞IFN-γ的分泌功能,并以LDH释放法测定NK细胞对K562细胞的杀伤活性.结果:在一个完整的化疗周期中,CD3~+、CD4~+、CD8~+细胞的绝对数目均于S_1期降至低点,且与S_0期分别都有显著性差异.与对照组相比,当体外给予自身肿瘤细胞裂解物刺激诱导培养后,在S_1、S_2和S_3期产生IFN-γ的CD8~+细胞比例均较对照组显著增加,且CD8~+IFN-γ~+细胞比例在S2期达到高.NK细胞的绝对数目于S1期降至低点,且与S0期有显著性差异,NK细胞的比例及杀伤活性在化疗前、后均无显著性差异.结论:卵巢癌患者于一线化疗后机体经历免疫重建的过程,该过程中CD8~+T细胞介导的免疫应答一过性增高,而NK细胞的杀伤活性无明显变化.化疗后免疫重建期可能是免疫治疗实施的佳窗口期.

云芝糖肽配合化疗对恶性肿瘤患者的评估

目的:系统评价云芝糖肽配合化疗对恶性肿瘤患者生活质量、血液系统及免疫功能的影响.方法:计算机检索MEDLINE、Pubmed等数据库.按Cochrane评价标准严格评价文献,纳入高质量研究.结果:共纳入7个研究,701例患者.Meta分析结果示:云芝糖肽具有一定改善恶性肿瘤病人化疗后生活质量的作用.云芝糖肽联合化疗药物组在改善白细胞、血红蛋白、血小板方面与单纯使用化疗药物或鲨肝醇联合化疗药物组之间无明显差异.云芝糖肽联合化疗药物组可提高CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+和CD_4~+/CD_8~+比值,而NK细胞无明显差异.结论:云芝糖肽配合化疗治疗恶性肿瘤有一定的疗效.但鉴于本系统评价纳入的研究大多质量低下,有必要进行更多的质量高、设计严谨、多中心的随机对照试验.

大蒜素对弓形虫感染小鼠体液免疫的影响

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种人畜共患的寄生虫病病原体,在宿主免疫功能低下时可造成严重后果,属机会性致病原虫.

小檗碱对DC-CIK增殖和杀瘤活性影响的初步研究

许多中药及中药复方可诱导细胞产生细胞因子或具有细胞因子样作用,且能增加免疫细胞活性,故可用于肿瘤的生物治疗.本课题研究了小檗碱(Berberine,Ber)对外周血来源DC和CIK增殖和杀HepG-2活性的影响,探讨小檗碱应用于肿瘤过继免疫治疗的潜能.

雌激素通过调节MSC分泌细胞因子影响其对DC成熟与功能的抑制

目的:本研究试图检测不同浓度17β雌二醇(F2)存在的情况下人胎肺间充质干细胞(MSC)增殖和表型的变化,并分析这种状态的MSC对树突状细胞(DC)成熟和功能影响及其可能的机制.方法:分离培养人胎肺MSC,加入不同浓度E2,在24小时后对MSC进行细胞计数、测定其增殖和贴壁能力,并用流式细胞仪分析MSC表面标志,RT-PCR测定MSC中细胞因子(IL-6、TGF-β和VEGF)mRNA的表达情况.进一步探讨了E2处理24小时后的MSC对DC成熟和功能的影响.结果:分离得到的MSC纯度达到95%以上;E2影响MSC的增殖和贴壁能力,但不影响MSC表面标记的表达;MSC与DC共培养后DC表面CD86、MHCⅡ和CD80的表达均有所降低,而当DC与经E2预处理过的MSC共培后,DC表面MHCⅡ、CD80和CD86的表达回升;高浓度E2作用MSC 24小时后,MSC表达的TGF-β与对照组相比减少,而IL-6和VEGF与对照组相比增加.结论:E2可能通过调节MSC分泌细胞因子的水平,改变MSC对DC的免疫抑制作用.

人Izumo蛋白的二级结构及B细胞抗原表位预测

目的:预测人Izumo蛋白的二级结构及B细胞抗原表位.方法:以人Izumo基因序列为基础,按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法预测其编码蛋白的二级结构,采用Karplus-Schulz方法预测Izumo蛋白骨架区的柔韧性;按Kyte-Doolittle方法预测其亲水性、Emini方法预测蛋白质表面可能性及Jameson-Wolf方法预测抗原性指数.结果:Chou-Fasman及Gamier-Robson两种方法预测的结果均表明,Izumo蛋白含较多的α螺旋,蛋白第6～17、30～40、88～99、103～120、153～160、173～188、249～260、283～297、334～338和339～346区段可能是α螺旋中心,第21～25、198～200、245～248和320～323区段可能是β折叠中心.用Kyte-Doolittle、Emini和Jameson-wolf方法分别对Izumo蛋白B细胞抗原表位进行预测结果表明,蛋白质第36～42、62～66、94～99、118～122、129～132、151～154、161～164、173～177、205～208、212～216、256～265、271～276、283～288、314～318和336～350区段附近很可能为B细胞表位优势区域.结论:该研究结果有助于确定Izumo蛋白的B细胞优势表位及发挥免疫避孕的活性部位.

CpG ODN对ZP~(121-140)表位合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应影响

目的:探讨CpG ODN对透明带(四)抗原表位ZP~(121-140)合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应影响.方法:应用人工合成ZP2~(121-140)表位肽,与20μg CpG ODN或等量完全弗氏佐剂(CFA)混悬后左胫前肌免疫雌性BALB/c小鼠,初次免疫后2、4、6周各加强免疫一次,共免疫四次.在每次加强免疫前和末次免疫后两周断尾取血,分离血清,分析特异性lgG抗体及非特异性细胞因子IFN-γ、TNF-Ⅱ,IL-10水平;收集小鼠阴道冲洗液,离心取上清,分析特异性IgA抗体水平.免疫小鼠生育实验结束后,取卵巢组织行病理学分析.结果:CpG ODN组诱导的特异性IgG和IgA水平较CFA组有增高趋势,但无显著性差异(P＞O.05).CpG ODN组诱导的非特异性IFN-γ和TNF-水平明显高于CFA组(P＜0.05);而CpG ODN组诱导的IL-10水平显著低于CFA 组(P＜0.05).两种佐剂对小鼠的受孕率影响没有显著性差异,但CpG ODN组孕鼠每胎产仔数明显低于CFA组(P＜O.05).病理学分析显示实验小鼠卵巢组织无病理性变化.结论:CpG ODN对Zp~(121-140)合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应略优于CFA,更适合用于避孕疫苗佐剂研究.

调节性DC在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病中的作用

多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一种常见的以中枢神经系统(Central nervous system,CNS)炎性脱髓鞘病变为特征的自身免疫性疾病,好发于青壮年,具有高复发率和高致残率,治疗棘手,通常造成脑组织的严重不可逆性损伤.

流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小胶质细胞与星形胶质细胞诱导趋化因子转录水平上调

目的:探讨胶质细胞感染流感病毒后的天然免疫反应,检测流感病毒H1N1和H5N1体外感染小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞,是否会诱导胶质细胞趋化因子转录水平的变化及其规律.方法:从新生小鼠大脑皮质分离培养神经胶质细胞,并进一步纯化小胶质细胞和星形胶质细胞,经纯度鉴定后,用感染复数为2的流感病毒H1N1和H5N1进行体外感染,8小时后用免疫荧光检测流感病毒核蛋白(NP)的表达,以确认感染细胞比例.在感染早期(6小时)和感染中期(24小时)分别提取细胞RNA,检测趋化因子转录水平的变化.结果:分离得到小鼠的小胶质细胞和星形胶质细胞,病毒感染后超过95%的细胞可以被感染,感染后的小胶质细胞与星形胶质细胞的CCI-3、CCL-5、CXCL-2、CXCL-9和CXCL-10的转录水平发生不同程度的上调,其中CXCL-10的上调幅度为明显,禽流感病毒H5N1感染能诱导更强烈的上调反应.结论:流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小胶质细胞与星形胶质细胞,可诱导趋化因子转录水平上调.

免疫抑制剂作为DNA疫苗佐剂的研究

目的:探讨免疫抑制剂作为DNA疫苗佐剂的免疫效果及预防自主免疫疾病的效果.方法:将三种免疫抑制剂环孢素(C&A)、他克莫斯(FK506)和霉酚酸酯(MMF)作为多发性硬化症(MS)的DNA疫苗佐剂,共同肌肉注射免疫小鼠.取小鼠脾脏抗体染色后,用流式细胞仪检测调节性T细胞(Treg)的比例及T细胞增殖反应,检测树突细胞(DCs)成熟状态及分泌白介素10(IL-10)的变化,并在诱导EAE动物模型后,检测临床打分的变化.结果:免疫FK506作为MS的DNA疫苗佐剂组显著提高了Treg细胞的比例,T细胞增殖反应显著受到了抑制,DCs细胞成熟受到抑制且IL-10的表达显著升高,能够显著降低小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的临床打分.结论:FKS06能够作为DNA疫苗的佐剂,诱导Treg细胞的产生,使机体产生免疫耐受,并能够在一定程度上预防自主免疫疾病的发生,为自身免疫性疾病的预防和治疗提供新的方法和思路.

免疫学领域国家自然科学基金项目2009年概况及2010年申报建议

1 2009年度免疫学领域国家自然科学基金的受理及评审情况1概况 2009年度免疫学科各类项目收到申请书的数量、受理申请书的数量、不予受理申请书的数量、获资助项目的数量、资助率、平均资助强度等情况见表1.

《中国免疫学杂志》征稿、征订启事