佐剂性关节炎大鼠肺功能变化与Foxp3、TGF-β1/Smads信号传导通路的相关性研究

目的:观察佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠肺系数、肺功能变化、调节性T细胞及Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达,探讨Foxp3与TGF-β/Smads信号传导通路在佐剂性关节炎大鼠肺功能降低中的可能作用机制.方法:将24只Wistar大鼠随机分为正常对照组和模型组,每组12只,向模型组大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1 ml致炎,复制成佐剂性关节炎模型.致炎48天后,观察两组大鼠足跖肿胀度及关节炎指数(AI),计算两组大鼠肺系数,检测大鼠肺功能,测定调节性T细胞百分率,HE染色观察肺病理学改变,免疫组化染色观察Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达情况.结果:①与正常对照组相比,AA模型组大鼠足跖肿胀度、AI、肺系数、1秒内平均呼气流量(FEV1/FVC)、肺泡炎积分、TGF-β1及Smad3蛋白表达明显升高(P＜0.01);用力肺活量(FVC)、25%肺活量的大呼气流量( FEF25)、50%肺活量的大呼气流量( FEF50)、75%肺活量的大呼气流量(FEF75)、大呼气中期流量(MMF)、用力大呼气流量(PEF)、肺动态顺应性(Cldyn)、CD4~+T细胞、CD25~+T细胞、CD4~+CD25~+T细胞百分率、Foxp3蛋白及Smad7蛋白表达显著降低(P＜0.01).②Spearman相关分析可知,AA大鼠肺功能参数中FEF50、MMF与足跖肿胀度呈负相关,MMF与肺系数呈负相关,Cldyn与TGF-β1蛋白积分光密度值呈负相关;FEF50、MMF与关节炎指数呈正相关,FEF75与肺系数呈正相关,FEV1/FVC与Foxp3蛋白表达染色指数、Foxp3蛋白积分光密度值呈正相关(P＜0.05或P＜0.01).结论:AA大鼠在足跖肿胀度、关节炎指数升高的同时出现肺功能的下降,提示可能是致炎后炎症的持续、发展而出现慢性炎症反应导致肺的损伤(肺间质纤维化),而肺功能的下降与Foxp3、Smad3、Smad7、TGF-β1蛋白表达呈相关性,说明转录因子Foxp3和TGF-β1/Smads信号传导通路共同参与其作用机制.

Cyr61促进RA滑膜细胞增殖及炎症因子调控研究

目的:采用类风湿性关节炎(RA)患者滑膜细胞的体外培养,研究基质蛋白Cyr61在RA滑膜细胞增殖中的作用及其机制.方法:通过Real-time PCR、Western blot和免疫组化检测RA病人的滑膜组织和细胞中Cyr61的表达情况;用3H-TdR掺入法检测滑膜液(SF)对滑膜细胞增殖的影响;用ELISA方法检测RA患者滑膜液中Cyr61蛋白的水平.结果:RA病人的滑膜组织和细胞中高表达Cyr61;SF能刺激滑膜细胞发生明显增殖;且RA患者滑膜液中含高浓度的Cyr61蛋白.用SiRNA干扰技术抑制滑膜细胞中Cyr61基因表达,再加入滑膜液后,则滑膜细胞增殖明显降低.同时,将SF与anti-Cyr61抗体共同孵育后再刺激滑膜细胞,FLS也不再发生明显增殖.进一步研究滑膜液中与上调Cyr61表达有关的炎症细胞因子,发现SF中IFN-γ和TNF-α具有上调Cyr61蛋白表达的作用.结论:Cyr61蛋白是促进滑膜细胞增殖的重要调控基因;RA患者滑膜液中含有高浓度的炎症因子IFN-γ和TNF-α,通过上调Cyr61蛋白表达而促进滑膜细胞增殖,可能是促进RA病理性滑膜增生的重要因素之一.

Th17细胞和Treg细胞在人类常见疾病中的表达及相互关系

辅助性17细胞(T help 17 cells,Th17)是近来发现的一种不同于Th1型和Th2型细胞、产生IL-17的Th细胞亚群,在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等疾病中发挥着重要的作用.

丝状真菌蛋白质组学研究

真菌是自然界中广泛存在的一类重要微生物,与人类的生产、生活密切相关.丝状真菌作为其中的类群,在食品、药品、酶剂、有机酸的生产和农业的生物防治等方面发挥着极大的作用.

白细胞介素1β诱导肾小管上皮细胞转分化及其对细胞骨架的影响

目的:观察白细胞介素1β(IL-1β)诱导肾小管上皮细胞转分化及其对细胞骨架的调节作用.方法:选择永生化的大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E,经体外培养后以IL-1β(30 μg/L)分别诱导3天及6天,观察细胞形态;RT-PCR半定量检测细胞α-平滑肌动蛋白(α-SMA)和细胞骨架成分β-actin、α-tubulin的 mRNA表达;免疫荧光染色观察α-SMA蛋白表达及骨架蛋白β-actin、α-tubulin在细胞内的分布及排列.结果:培养的NRK52E细胞经IL-1β体外诱导3天及6天后,细胞中α-SMA mRNA及蛋白表达水平与相应的对照组细胞比较明显增多(P＜0.001),提示NRK52E上皮细胞出现了表型转化,此时培养细胞的形态也发生了改变,由典型的多边铺路石样变为成纤维细胞样,并有多个突起,细胞骨架蛋白β-actin mRNA的表达也稍有增多(P＜0.05);其蛋白的分布排列也发生了改变,由胞膜转移至核周及胞浆,形成束状纤维样结构.但IL-1β诱导组细胞的另一个骨架蛋白α-tubulin mRNA表达和分布与对照组比较无明显不同.结论:IL-1β能够诱导体外培养的NRK52E细胞转分化,此过程中细胞形态变为成纤维细胞样,多突起;骨架蛋白β-actin也表达增加,并出现了骨架重建;而α-tubulin在此过程中则没有明显变化.

利用小鼠感染模型筛选与鉴定幽门螺杆菌外膜蛋白抗原

目的:利用小鼠感染模型筛选与鉴定幽门螺杆菌SS1株的外膜蛋白抗原.方法:提取SS1株的外膜蛋白进行双向电泳,用幽门螺杆菌感染的小鼠血清作免疫印迹实验,将阳性反应蛋白点进行质谱鉴定分析,将肽质量指纹谱数据输入互联网上的蛋白质数据库进行检索.结果:获得32种抗原相关蛋白.通过与已有报道的幽门螺杆菌感染人抗原比较分析,发现大部分典型的保护性抗原在本实验中都可以检测到.结论:幽门螺杆菌感染的小鼠模型适用于人用保护性幽门螺杆菌抗原的筛选;而且此研究中得到的相关抗原蛋白对于寻找与鉴定幽门螺杆菌未知保护性抗原也有参考价值.

HCV HLA-A2限制性复合多表位基因的构建、克隆表达及其免疫特性分析

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)HLA-A2限制性复合多表位基因的原核表达载体,表达纯化,并观察其免疫原性.方法:分别合成HCV HLA-A2限制性多表位基因、人泛素基因,串联后得到融合基因Ub-Mep,克隆入原核表达质粒pRSET-A,转化E.coli BL21,IPTG诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白组成;可溶性分析后用Ni~(2+)-NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白;Western blot分析纯化蛋白的特异性和抗原性;免疫小鼠分析其免疫原性.结果:成功构建复合多表位抗原基因的原核表达质粒pRSET-Ub-Mep,目的基因可高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,Ni~(2+)-NTA 纯化可获得目的蛋白,纯化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性.结论:成功构建HCV HLA-A2限制性复合多表位基因并进行原核表达,表达的多表位基因抗原具良好的免疫原性,为进一步的HCV A2限制性复合多表位诱导的细胞免疫应答研究奠定基础.

Ghrelin活化人T细胞翻译起始分子通过mTOR信号转导通路

目的:探讨Ghrelin活化人T细胞翻译起始分子的信号转导机理.方法:采用微柱法分离人外周血T细胞,采用Western blot方法检测mTOR信号通路分子和蛋白质翻译调控分子的磷酸化状态和含量.采用mTOR抑制剂:雷帕霉素,PI3KⅠ抑制剂:LY294002,PI3K Ⅲ抑制剂:3-甲基腺嘌呤,Ghrelin拮抗剂:Des-Lys-3-GHRP6和AKT抑制剂:A443654和Ghrelin研究相应信号通路.结果:①人T细胞表面有Ghrelin受体(GHSR1a)表达.②Ghrelin与GHSR1a结合后可活化mTOR.③Ghrelin磷酸化两个mTOR下游靶分子4E-BP-1 和P70 S6K,P70 S6K进一步磷酸化核糖体S6蛋白.④Ghrelin磷酸化蛋白质翻译起始帽子结构的两个重要分子eIF4E和eIF4G.结论:Ghrelin促进人T细胞mRNA翻译起始的机理是活化mTOR信号转导通路.

卡氏肺孢子菌pVAX-p55-v3及pVAX-p55-v0真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建卡氏肺孢子菌p55-v3及p55-v0抗原基因真核表达载体,mRNA水平鉴定其在COS-7细胞中的表达.方法:以卡氏肺孢子菌总RNA为模板,RT-PCR技术扩增p55-v3及p55-v0抗原基因,连接至pTA2载体,再克隆到pVAX1真核表达载体,构建重组质粒pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0.重组质粒在感受态DH5α大肠杆菌中大量扩增后,转染至COS-7细胞,RT-PCR鉴定其在mRNA水平的表达.结果:构建的重组质粒经酶切及测序鉴定,与文献报道的同源性分别达到99.8%和99.9%;其编码的氨基酸与文献报道的同源性为100%.RT-PCR显示p55-v3和p55-v0成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达.结论:本研究成功构建了pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步阐明p55-v3的免疫保护功能以及核酸疫苗的研究提供了基础.

尘螨变应原Der f1植物表达载体的构建及表达

目的:构建尘螨变应原Der f1植物表达载体并侵染烟草叶片表达.方法:从保存的含pET28a(+)-Der f1的甘油菌株中扩增Der f1基因,并克隆到质粒载体中,提取质粒,进行测序;以ClaⅠ、SalⅠ双酶切,将Der f1基因克隆到马铃薯X病毒(PVX)载体中,构建植物病毒表达载体;将PVX-Der f1转化脓杆菌,挑取Kan、Tet抗性阳性的菌株侵染烟草叶片进行蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定和分析.结果:经SDS-PAGE分析,有4株烟草叶片蛋白提取物在34Mr处有特异性蛋白条带;经Western blot进一步验证其变应原,结果显示,烟草叶片中获得的重组蛋白在34M_r处与阳性血清发生特异性结合,而与阴性血清并不发生结合.结论:成功构建了植物病毒表达载体PVX-Der f1并获得表达,为尘螨变应原Der f1的研究提供新思路.

sH-2K~d-HBc四聚体的构建及其初步的检测应用

目的:sH-2K~d-HBc复合物四聚体的构建与检测,为进一步检测抗原特异性T细胞,探讨免疫发病机制奠定基础.方法:将四个生物素化的可溶性复合物单体与荧光标记的亲和素结合形成四聚体.采用HBcAg真核表达质粒(pcDNA3-C)通过不同的途径免疫小鼠,获得针对核心抗原的特异性CTL,与制备的四聚体共孵育,结合流式细胞仪术进行检测.结果:三种免疫方法所得到的细胞中,抗原特异性CTL频数较对照组都有明显提高(0.24%,0.26%,0.36% vs 0.07%,P≤0.05).显示制备的四聚体能与抗原特异性T细胞结合,具有检测功能.三种不同的免疫途径所引起的抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答强度各有不同.与传统的肌肉注射组相比,基因枪免疫组的体液免疫应答水平较弱而细胞免疫应答水平较强.高压水注射(HDI)组的体液免疫应答和细胞免疫应答水平都要明显高于肌肉注射组结论:获得了功能性的sH-2K~d-HBc复合物四聚体,为进一步检测抗原特异性T细胞奠定基础.

博莱霉素诱导小鼠肺间质纤维化造模方式的选择

目的:建立博莱霉素导致肺间质纤维化小鼠动物模型,比较不同给药方式的成模差异.方法:利用8周龄雄性ICR小鼠,①随机分为腹腔给药组(P 组)、气管内给药组(I组)、阴性对照组(C组),分别经腹腔注射BLM 40 mg/kg 5次、气管内滴入BLM 5 mg/kg 1次或气管内滴入生理盐水50 μl.分别于14、28、40天处死,②小鼠随机分为4组,分别经腹腔注射BLM 40 mg/kg~3、4、5次或经腹腔给予生理盐水200 μl.分别于28、40天处死.观察小鼠体重、咳嗽、挠鼻症状、肺系数及肺组织病理改变.结果:给予博莱霉素后①小鼠的体重均下降并出现咳嗽及挠鼻等呼吸障碍症状;处置后第14、28及40天处死小鼠,计算肺系数,P组较I组肺系数高;处死小鼠后,P组和I组小鼠均形成广泛、稳定的间质纤维化病理改变,P组主要分布在胸膜下及血管周围,而I组主要分布在肺门和支气管周围.P组较I组肺纤维化病理评分高.②不同腹腔给药次数模型小鼠体重变化以5次给药对体重影响大;计算肺系数以给药5次肺系数变化大.上述模型均成功建立.通过比较生存率、呼吸困难症状、组织病理变化等指标,选出腹腔给药5次相对于给药3次及4次为更好的造模方式.结论:利用BLM腹腔注射和气管内滴入制备了肺间质纤维化动物模型,纤维化形成的部位存在着一定的差异,腹腔给药5次方法制备肺间质纤维化模型的成功率更佳.

人Argonaute2蛋白多克隆抗体制备及初步应用

目的:制备人Argonaute2(Ago2)的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位.方法:用DNAstar软件寻找抗原性高的Ago2序列区域(命名为k-Ago2),构建k-Ago2的表达质粒,转化大肠杆菌并诱导表达.融合蛋白经切胶回收纯化后免疫大白兔制备抗体.以ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测Ago2在细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察Ago2的细胞定位.结果:成功构建表达质粒,继而k-Ago2得以表达与纯化,免疫大白兔后得到Ago2多克隆抗体.ELISA检测抗体效价为1∶19 000,Western blot确定抗体具有高度特异性,并成功地用该抗体检测到Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位.结论:Ago2多克隆抗体的成功制备,对RNAi机制的深入研究及其进一步的临床应用均具有重要价值.

热处理淋巴瘤细胞增强树突状细胞介导的抗瘤效应研究

目的:探讨淋巴瘤细胞热处理后作为抗原,冲击树突状细胞而引发的抗淋巴瘤免疫效应.方法:用健康人外周血分离出单核细胞,体外培养树突状细胞(Dendritic cells,DCs),将淋巴瘤细胞株热处理(42℃,2小时)培养24小时后负载于DCs,在流式细胞仪上检测DCs的免疫表型变化;负载抗原后的DCs与淋巴细胞混合反应,以MTT法评价细胞毒性及在流式细胞仪上检测淋巴细胞的免疫表型;ELISPOT法检测细胞内因子IFN-γ的释放.结果:在两实验组中,DCs负载了热处理的淋巴瘤抗原后,细胞表面的共刺激分子和MHCⅡ类分子表达水平较对照组明显增加(P＜0.05),而两组之间差别无显著性(P＞0.05);经热处理的肿瘤细胞负载于DCs后,与淋巴细胞混合后IFN-γ的释放量明显增加;混合淋巴细胞反应后,细胞毒性实验(MTT法)和流式细胞仪检测结果均显示两实验组的杀瘤作用强于对照组(P＜0.05),两组之间无显著差别(P＞0.05).结论:用热处理的淋巴瘤细胞作为肿瘤抗原冲击DC,能够增强抗淋巴瘤效应.

穿心莲内酯对人PBMC/PBM表达IL-18相关细胞因子的影响

目的:研究穿心莲内酯对外周血单核细胞表达IL-18相关细胞因子的影响.方法:不同浓度穿心莲内酯处理LPS刺激的PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cells,外周血单个核细胞)和LPS+IFN-γ/IL-4激活的磁珠分选PBM(Peripheral Blood Monocytes,外周血单核细胞),利用real-time RT-PCR法检测IL-18、IL-18BP、IL-18Rα、IL-18Rβ基因转录水平,ELISA法检测PBM上清中的IL-18、IL-18BP和IL-1β、IL-1Rα.结果:穿心莲内酯呈剂量和时间依赖地调节PBMC IL-18和IL-18BP的表达.穿心莲内酯处理使LPS刺激的PBMC IL-18BP转录增加,IL-18BP/IL-18比值升高;使LPS+IFN-γ激活的PBM表达IL-18BP/IL-18比值从9.60倍升高至214倍;IL-4激活的PBM表达IL-1Rα/IL-1β比值从9 200降低至6 520.结论:穿心莲内酯可调节激活的外周血单核细胞IL-18相关基因转录和表达,抑制炎症时IL-18的高表达.

癌迪针剂对荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的:研究癌迪针剂对肿瘤的作用效果及其抗肿瘤免疫效应机制.方法:选用H22肝癌荷瘤小鼠注射癌迪针剂7天后,观察荷瘤小鼠肿瘤抑制率、胸腺、脾脏指数、淋巴细胞转化功能、腹腔巨噬细胞吞噬功能、TNF活性、IL-2及血清IFN-α水平.结果:癌迪针剂可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长;能提高荷瘤小鼠的淋巴细胞转化功能;可增强巨噬细胞吞噬活性和TNF活性;能提高IL-2和IFN-α水平.结论:癌迪针剂能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长,增强机体的免疫功能.

慢性乙型肝炎患者外周血CD4~+CD25~+Treg与CD4~+和CD8~+T淋巴细胞亚群的相关研究

目的:探讨慢性乙型肝炎患者外周血中CD4~+CD25~+调节性T细胞的含量和CD4~+CD8~+T淋巴细胞亚群分布,两者之间相关性及与HBV的相关性.方法:采用流式细胞术检测50例慢性乙型肝炎患者和20例健康对照者外周血中CD4~+CD25~(high)、CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞表达及CD3/CD4/CD8 T淋巴细胞亚群,荧光定量PCR法检测HBV DNA含量.结果:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4~+CD25~(high)Treg明显高于健康对照组(P＜0.01),且随HBV DNA载量增加,患者外周血中CD4~+CD25~(high)Treg细胞的水平逐渐升高.慢性乙型肝炎患者外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞也相应增高,且与CD4~+CD25~(high)Treg细胞的变化成正相关(r=0.890,P＜0.001).与健康对照组比较,患者组CD4~+T细胞百分率及CD4~+/CD8~+比值均降低,而CD3~+T细胞和CD8~+T细胞百分率差异无显著性(P＞0.05).CD4~+CD25~(high)Treg细胞与HBV DNA取对数后成正相关(r=0.782,P＜0.001),与谷丙转氨酶(ALT)成正相关(r=0.432,P＜0.005);与CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞水平及CD4~+/CD8~+比值均无相关性(P＞0.05).CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞及CD4~+/CD8~+比值与HBV DNA载量之间亦无相关性(P＞0.05).结论:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4~+CD25~+Treg细胞增高,且与HBV的复制水平及ALT增高具有一致性,而T细胞亚群是否可作为监测CHB患者免疫状态的指标需进一步探讨.

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发病高峰期外周及中枢淋巴细胞亚群的变化

目的:观察髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG_(35-55)诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发病高峰期中枢及外周淋巴细胞亚群的变化,探讨EAE发病高峰期细胞与体液免疫学的变化.方法:用MOG_(35-55)免疫诱导雌性C57BL/6小鼠制作EAE模型,记录小鼠行为学变化,HE染色观察CNS炎症组织病理变化,使用流式细胞仪检测小鼠中枢及外周脾脏淋巴细胞中CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+、CD4~+CD25~+、B220~+细胞亚群变化情况.结果:EAE组小鼠中枢神经系统有CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+、CD4~+CD25~+、B220~+淋巴细胞的浸润, CFA阴性对照组中枢神经系统未检测到淋巴细胞浸润.EAE组小鼠外周脾细胞中CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+细胞较CFA阴性对照组减少(P＜0.05), B220~+细胞较CFA阴性对照组明显升高(P＜0.01),CD4~+CD25~+细胞较CFA阴性对照组升高但无统计学差异.结论:小鼠在EAE发病高峰期,外周脾细胞中CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+阳性细胞明显减少,B220~+明显升高, CD4~+CD25~+也开始有升高趋势,表明EAE发病高峰期细胞免疫及体液免疫共同调控了EAE的病理过程,T淋巴细胞与B淋巴细胞都起了很重要的主导作用.

本刊拟聘特约审稿人

本刊加入"万方数据——数字化期刊群"的声明