化疗联合自体DCIK细胞治疗急性白血病的临床研究

目的:采用体外培养的树突状细胞(Dendritic cell,DC)致敏、细胞因子诱导激活的杀伤细胞(Dendritic Cells with Cytokine-induced Killer,DCIK)治疗急性白血病患者,探讨DCIK细胞过继免疫治疗的临床疗效及安全性.方法:采用血细胞分离机分离患者外周血中单个核细胞,在体外诱导培养成DCIK细胞,流式细胞术检测外周血淋巴细胞免疫表型,MTT法检测DCIK细胞对人红白血病细胞K562的杀伤活性.经过质量检定合格后,回输给患者.观察输注期间的不良反应,治疗结束后定期复查患者血液学及遗传学缓解情况.结果:①回输给患者的细胞群中,CD3+CD56+细胞占(38.62±9.32)%,其对白血病细胞株K562的杀伤率为(57.6±2.9)%,回输后患者外周血CD8+、CD56+细胞百分比分别为(36.93±5.78)%、(41.94±13.15)%.②21例患者共接受50例次DCIK细胞治疗,1例接受9疗程治疗,1例接受7疗程治疗,2例接受4疗程治疗,1例接受3疗程治疗,4例接受2疗程治疗,11例接受1疗程治疗.自DCIK细胞回输开始,随访至2009年11个月底,中位随访时间14个月(2～44),3年总生存率(Overall survival,OS)、3年无事件生存率(Event free survival,EFS)分别为(61.9±18.5)%、(43.1±15.7)%.13/21例(61.9%)持续缓解,中位持续缓解时间为17个月(2～44),共8例复发(1例分子水平复发,7例血液学复发).③21例患者中,DCIK细胞治疗时处于第1次缓解(First complete remission,CR1)期15例,11例持续缓解,4例复发;≥第2次缓解(Second complete remission,CR2)期6例,4例复发,2例持续缓解.④所有患者输注过程安全,无输注相关不良反应,无心电图及肝肾功能损害.结论:DCIK细胞治疗明显改善急性白血病的临床症状,是一种安全有效的治疗方法.

Treg细胞在VIP治疗实验性类风湿性关节炎中的作用研究

目的:本研究探讨血管活性肠肽(VIP)治疗实验性类风湿性关节炎的免疫调节机制及Treg细胞参与的调节.方法:本研究以鸡Ⅱ型胶原(CCⅡ)诱导的Wistar大鼠实验性类风湿性关节炎(CIA)为动物模型,分析大鼠关节指数评分和关节病理变化,通过细胞因子检测分析Th1/Th2平衡关系;通过流式细胞术和功能实验分析Treg的变化,评价VIP的治疗作用和机制.结果:我们的研究显示体内经VIP治疗的CIA大鼠在临床和组织学水平均得到了保护和缓解.其抑制作用与下列因素有关:抑制致病性T细胞的增殖,免疫应答由Th1型应答向Th2型应答转换,以及上调了具有抑制T细胞活化和增殖作用的CD4+CD25+ Treg细胞数量与功能.结论:本研究揭示了VIP可通过调节Th1/Th2平衡和上调Treg细胞来抑制致病性T细胞的活性,从而保护、缓解实验性关节炎.

一种新型的免疫载体-MHCⅡ类分子的恒定链

MHCⅡ类分子的α、β链在内质网中与γ链聚合,形成九聚体(αβγ)3.不同于α、β链的多态性,γ链呈非多态性,故称为恒定链(Invariant chain,Ii).Ii链属Ⅱ型跨膜糖蛋白,存在于T、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肿瘤细胞表面,白细胞分化抗原编号为CD74[1-6].

微小RNA(microRNA)与免疫细胞分化及功能调节

1993年,Victor Ambros在线虫 (C.elegans) 中发现 lin-4 基因产生一种小 RNA 分子(microRNA,miRNA),它能通过与靶基因的3′非翻译端( 3′untranslational region,3′UTR)的特定区域相互作用来抑制其表达,控制 C.elegans 幼虫的发育[1].

PcDNA3.1-rhGM-CSF表达质粒的构建及其对K562细胞生长与分化的影响作用

目的:观察GM-CSF对髓系白血病细胞(K562)生长、分化的影响作用.方法:采用PCR、T-A克隆及基因定向克隆技术,将rhGM-CSF基因插入PcDNA3.1(+)空载体中,构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核表达载体.经限制性内切酶消化和DNA测序鉴定确认,转染人K562髓系白血病细胞、72小时后采用细胞形态学检测、MTT试验、免疫组化技术观察和分析PcDNA3.1-rhGM-CSF在K562细胞中的表达及其影响该细胞生长与分化的作用.结果:①成功构建PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体;②重组质粒PcDNA3.1-rhGM-CSF能在K562细胞中表达,并诱导K562细胞向单核细胞系、巨噬细胞系分化;③K562细胞增殖受到明显抑制.结论:成功构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体;转染K562细胞能向单核细胞系、巨噬细胞系分化.

HSP60通过Toll样受体对ApoE-/-小鼠树突状细胞功能影响研究

目的:探讨HSP60通过Toll样受体(TLR)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导在体外对ApoE-/-小鼠树突状细胞(mDC)的功能影响.方法:将ApoE-/-小鼠构建动脉粥样硬化模型后,从骨髓提取DC,体外培养成熟后分三组:HSP组、 LPS组及对照组,分别与HSP60、LPS及生理盐水孵育后,应用流式细胞仪检测细胞表面TLR及CD80水平,RT-PCR检测TLR的mRNA水平,免疫印迹法检测MAPK家族中p38及ERK水平;上清液用ELISA法检测IL-6及TNF-α水平.结果:与对照组比较,HSP组中DC表达TLR及MAPK家族水平、成熟标记物CD80水平、分泌IL-6及TNF-α水平均明显升高(P＜0.01);但与LPS组比较则无显著差异(P＞0.05).结论:HSP60通过TLR介导MAPK信号转导参与动脉粥样硬化模型mDC的活化过程.

重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISS)转染DC培养上清诱导HepG2株凋亡的研究

目的:探讨人类乙肝核心抗原重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISS)转染人外周血单核细胞来源树突状细胞后,细胞培养上清诱导肝癌细胞株HepG2凋亡的作用及机制.方法:构建真核表达质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa,c),将其转染人外周血来源DC,用培养上清诱导HepG2的凋亡.用流式细胞仪检测已转染DC表面CD80和CD86的表达,检测培养上清诱导HepG2凋亡的变化.用ELISA法检测转染后DC培养上清的IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-4和IL-10的水平.结果:pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa)转染DC表面CD80和CD86的表达均有明显升高(P＜0.01).转染后上清中Th1型细胞因子 IFN-γ、IL-2和IL-12的表达增强(P＜0.01),Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达下降(P＜0.05),pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa)组培养上清对HepG2细胞具有促凋亡作用,随着培养时间延长,细胞凋亡率逐渐增加,HepG2细胞在诱导后24小时凋亡率达到大,为18.4%.结论:重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa)转染培养上清能明显促进肝癌细胞株HepG2的凋亡.

hPPARγ2单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备鼠源抗hPPARγ2单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定.方法:利用已建立的pMD18-T/hPPARγ2亚克隆扩增出hPPARγ2前1 017 bp cDNA.利用pET原核表达系统表达了含有hPPARγ2前339个氨基酸(C-Histag)融合蛋白,并进行了纯化.其次利用原核表达的重组hPPARγ2蛋白制备了特异性抗hPPARγ2单克隆抗体1B4、3H2、3H10、10D6和10D8.通过ELISA和Western blot及细胞免疫化学的方法对抗体进行了特异性鉴定.结果:成功制备了鼠抗hPPARγ2单克隆抗体,并证明这5株单抗均为hPPARγ2的特异性抗体.结论:制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌高特异性的hPPARγ2抗体.这些系统的建立和鼠抗hPPARγ2单克隆抗体的制备为后续的针对hPPARγ2作用及机制研究提供了良好的工具.

人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定

目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定.方法:从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,用直接PCR及半巢式PCR扩增人抗体重链(VH)及轻链(Vκ和Vλ)可变区基因.采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL(Vκ和Vλ)基因连接成人单链抗体(scFv)基因,并将scFv文库基因克隆到噬菌体载体pCANTAB-5E中,电转化E.coli TG1,构建单链抗体文库.结果:采用直接PCR和半巢式PCR扩增得到42条VH基因片段,16条Vκ基因片段,18条Vλ基因片段.混合的VH和VL等摩尔比连接后,产生的单链抗体文库基因大小为750 bp左右;转化后构建了文库容量为1.35×108的单链抗体文库.BstN Ⅰ酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示,酶切得到的scFv指纹图谱均不相同.结论:构建的抗体文库多样性好,可用于多种人源性单链抗体的筛选.

一种利用HCIC快速纯化抗rhTF243单克隆抗体方法的研究

目的:建立从小鼠腹水中快速纯化抗人重组组织因子243(recombine human tissue factor 243,rhTF243)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的方法.方法:含抗rhTF243单克隆抗体的腹水经离心、过滤及缓冲溶液变换等预处理后,先经疏水电荷诱导层析纯化处理,去除大部分杂蛋白,再经Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析柱进一步纯化.结果:经两步纯化后获得抗rhTF243 单克隆抗体,其生物学活性高、纯度大于95%,抗体效价保持良好,抗体总回收率达73%,且具有明显的抗促凝作用.结论:建立的单克隆抗体纯化方法简便、高效,所得mAb的纯度高、生物学活性好.

环丙沙星单克隆抗体的制备及其免疫学特性分析

目的:制备环丙沙星单克隆抗体,并分析其免疫学特性,为建立环丙沙星残留的免疫学检测方法服务.方法:用人工抗原环丙沙星-小牛血清白蛋白偶联物免疫BALB/c小鼠,产生预期免疫应答后,将小鼠脾细胞与瘤细胞融合,经初筛、复筛和再克隆,筛选得到1C9、3F6、6H2、6A7、6G11和8F5 6株分泌环丙沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞.对单克隆抗体的亚型、纯度、亲和力、灵敏度及特异性等免疫学特性进行鉴定和分析.结果:1C9、3F6和6A7的抗体亚型为IgG2a;6H2和8F5的抗体亚型为IgG1;6G11的抗体亚型为IgG3.SDS-PAGE电泳结果显示单抗蛋白重链分子量约为50 kD,轻链分子量约为25 kD.6株细胞产生的单抗均具有良好的特异性和灵敏度.其中,细胞株1C9细胞培养上清和腹水效价分别为1:6.4×102和1:5.6×105,亲和力常数可达2.85×109 L/mol,IC50值可达245.86 ng/ml,低检测限为45.25 ng/ml,对氧氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星、左氧氟沙星、孔雀石绿、氯霉素、呋喃西林等药物几乎不存在交叉反应,与恩诺沙星存在交叉反应,交叉反应率为84.6%.结论:本方法制备的环丙沙星单克隆抗体具有较好的亲和力和特异性,可用于环丙沙星残留免疫学检测.

髓系抑制性细胞在小鼠肝癌免疫逃逸中的作用

目的:研究荷瘤小鼠脾脏中髓系抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)比例的变化及在组织中的分布,探讨其在肝癌免疫逃逸中的作用.方法:采用肝癌细胞原位移植法建立小鼠原位肝癌模型,流式细胞仪检测正常小鼠和荷瘤小鼠7、14、21天脾脏中MDSCs的比例,免疫组织化学染色对其进行定位分析.结果:荷瘤小鼠脾脏中MDSCs的比例比正常小鼠显著增高(P＜0.05),而且随着荷瘤时间的延长,MDSCs的比例逐渐增加.正常小鼠脾脏中少量的MDSCs散在分布于红髓区,荷瘤后大量MDSCs主要聚积在边缘区及白髓区的动脉周围淋巴鞘.结论:小鼠脾脏中MDSCs的比例与肿瘤进展相关,且主要分布在脾脏胸腺依赖区.

重组灵芝免疫调节蛋白抑制HL60细胞增殖及诱导凋亡的研究

目的:探讨重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)对HL60细胞抑制作用及诱导凋亡的研究.方法:采用MTT法检测rLZ-8对HL60细胞的体外杀伤作用;通过AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡率;应用钙离子荧光探针Fluo-3/AM染色,检测rLZ-8作用HL60细胞后细胞内钙离子浓度变化;分光光度法测定细胞caspase-3活性.结果:rLZ-8可明显抑制HL60细胞增殖,随着rLZ-8浓度增加,细胞凋亡率也增加;激光共聚焦检测细胞内钙离子水平明显升高,并且细胞内caspase-3活性增高.结论:rLZ-8可诱导HL60细胞发生凋亡,细胞内钙超载及caspase-3活性增高可能是rLZ-8诱导HL60细胞凋亡的途径之一.

IL-18在大鼠抗肾小球基底膜肾炎凋亡中作用的研究

目的:探讨IL-18在大鼠抗肾小球基底膜肾炎细胞凋亡中的作用.方法:复制大鼠抗GBM肾炎模型,分别于实验第2、7、14、21和28天,行以下处理:收集24小时尿、血清样本检测大鼠24小时尿蛋白、血肌酐及血尿素氮含量;取肾组织经光镜、电镜观察肾组织病理变化;采用TUNEL法检测大鼠肾组织细胞凋亡情况;RT-PCR、免疫组织化学和Western blot法分别检测肾组织中IL-18、Fas mRNA和蛋白表达情况.结果:与正常对照组相比,肾炎模型组24小时尿蛋白、血肌酐和血尿素氮含量均明显升高(P＜0.01);光镜和电镜观察到肾小球内可见新月体形成、GBM不规则增厚、足突融合等病变;肾小球内凋亡细胞于第2天开始轻度增加,随后继续增加,于第28天有所减少,但仍维持较高水平;血清IL-18含量第2天开始升高,此后一直维持较高水平;肾组织中IL-18、Fas mRNA和蛋白表达均显著增加(P＜0.01);且肾炎模型组血清、肾组织IL-18表达与Fas表达均呈正相关(P＜0.01).结论:IL-18在大鼠抗GBM肾炎凋亡中发挥重要的促进作用.

HLA-G蛋白在子宫腺肌病中的表达及其作用机制

目的:探讨HLA-G蛋白在子宫腺肌病中的作用机制.方法:采用免疫组织化学染色方法与Western blot方法检测31例子宫腺肌病患者在位与异位内膜组织HLA-G蛋白表达,18例子宫肌瘤患者正常子宫内膜作为对照.结果:子宫腺肌病患者在位与异位内膜组织腺上皮、间质细胞均有HLA-G蛋白表达,而子宫肌瘤患者(对照组)正常内膜中未检测到HLA-G蛋白;子宫腺肌病患者在位与异位内膜组织HLA-G蛋白表达无显著性差异(P＞0.05);子宫腺肌病患者在位内膜分泌期和增生期HLA-G蛋白表达无显著性差异(P＞0.05).结论:子宫腺肌病患者在位与异位内膜组织HLA-G蛋白异常表达,可能与其发病有关.

Nrf2和HO-1在实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓中的动态表达及依达拉奉保护机制的研究

目的:探讨依达拉奉对实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠的影响及作用机制.方法:应用豚鼠脊髓匀浆抗原(GPSCH)免疫Wistar大鼠建立EAE模型,随机分为对照组、EAE组、依达拉奉小剂量组、依达拉奉大剂量组及地塞米松组(DXM),比较各组不同时间点的发病率并进行神经功能评分,脊髓组织切片进行HE染色、三色染色观察病理变化,免疫组化染色观察Nrf2及血红素加氧酶(HO-1)表达.结果:依达拉奉大剂量组(8.33%)和DXM组(0%)的发病率均低于EAE组(58.3%)(P＜0.05);在发病高峰期时,依达拉奉大剂量组(0.32±1.10)、DXM组(0)各大鼠神经功能评分明显低于EAE组(2.06±2.01)及依达拉奉小剂量组(1.21±1.51)(P＜0.05);依达拉奉大剂量组(1.25±1.67)、DXM组(0)大鼠16天时脊髓组织内炎症细胞浸润形成的血管袖套数目明显低于EAE组(8.17±3.49)及依达拉奉小剂量组(7.67±4.37)(P＜0.05);依达拉奉大剂量组的轴突及髓鞘损伤程度较EAE组和依达拉奉小剂量组轻;与正常组比较,EAE组、依达拉奉小剂量组、依达拉奉大剂量组及DXM组大鼠的脊髓组织中Nrf2及HO-1表达均上调,依达拉奉大剂量组的表达数目高,且与其他组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:依达拉奉可以降低EAE大鼠的发病率,减轻发病时神经功能损伤的程度以及脊髓内炎性细胞浸润的程度,其神经保护作用可能是通过上调Nrf2及HO-1的表达,发挥抗氧化应激作用来实现的.

CD4+ CD25+ CD127- T细胞在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受中的作用

目的:研究CD4+CD25+ CD127- T细胞在抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受中所发挥的作用,从而阐明抗CD45RB抗体诱导免疫耐受作用的机制.方法:体内实验建立小鼠异位心脏移植模型,观察抗CD45RB抗体对移植物生存期的影响.体外实验观察抗CD45RB抗体对T细胞增殖抑制能力和对CD4+CD25+ CD127- T细胞生成的影响.流式细胞术检测外周血和混合细胞中CD4+CD25+ CD127- T细胞百分率,ELISA法检测血清和培养液中IL-2和IL-10含量,Real-Time PCR法检测脾脏和混合细胞中Foxp3基因的表达,移植心脏病理学观察.结果:抗CD45RB抗体显著延长移植物存活时间(P＜0.01),对ConA刺激引起的T淋巴细胞增殖具有明显的抑制能力(P＜0.05).与对照组相比,实验组CD4+CD25+ CD127- T细胞百分率和Foxp3 mRNA表达量均明显增加(P＜0.05),实验组IL-2水平较对照组明显降低(P＜0.05),但IL-10含量较对照组明显升高(P＜0.05).病理结果显示对照组移植心脏出现典型细胞免疫性损伤病理改变,而实验组中几乎无炎性细胞浸润现象.结论:抗CD45RB抗体能显著延长移植物存活时间,其诱导免疫耐受机制与上调CD4+CD25+ CD127- T细胞百分率和增加Foxp3 mRNA表达量有关.

NKT细胞发育及功能研究进展

自然杀伤T细胞(Natural killer T cells,NKT细胞)是一类天然存在的介导先天性免疫和获得性免疫的重要淋巴细胞,参与机体的抗感染、抗肿瘤、移植免疫和自身免疫调节作用.NKT细胞的来源、选择分化和成熟过程及其调控研究有了很大的进展,同时在这些过程中仍存在一些备受争议和值得深入研究的问题.清楚了解NKT细胞的分化发育过程和调控机制,结合NKT细胞的生物学功能特征,将对临床预防和治疗相关的免疫性疾病具有重要的指导意义.

鸡Ⅰ类抗原递呈分子亚单位与恒定链的细胞定位及相互关系研究

目的:研究鸡Ⅰ类抗原递呈分子亚单位和鸡恒定链的细胞定位及相互关系.方法:RT-PCR获得鸡MHCⅠ类分子α、β2m亚单位,并进一步构建了能表达红色和绿色荧光蛋白的α、β2m亚单位的真核表达载体,利用脂质体介导法与能表达增强型绿色荧光的Ii真核表达载体共转染COS-7细胞,荧光显微镜检测Ii与MHCⅠ亚单位的细胞定位,并通过免疫共沉淀进一步研究它们之间的相互关系.结果:GFP-Ii与MHCⅠα-RFP、MHCⅠβ2m-RFP在细胞中共表达后出现共定位现象,且共定位于细胞的内膜系统;免疫共沉淀结果显示,只有当GFP-Ii链与MHCⅠα-GFP、MHCⅠβ2m-GFP三者共转染后,才可以检测到MHCⅠα-GFP、MHCⅠβ2m-GFP的表达.结论:鸡Ii与单个的MHCⅠα、MHCⅠβ2m亚单位不能有效结合,Ii只有与完整的Ⅰ类抗原递呈分子才能够形成复合体,且共定位于细胞的内膜系统.

《中国免疫学杂志》关于彩图处理的有关说明