中国肿瘤生物治疗杂志
Chinese Journal of Cancer Biotherapy 중국종류생물치료잡지
- 主管单位: 中国科学技术协会
- 主办单位: 中国免疫学会,中国抗癌协会
- 影响因子: 0.69
- 审稿时间: 1-3个月
- 国际刊号: 1007-385X
- 国内刊号: 31-1725/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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突变N-ras基因重组痘苗病毒rV-N-ras/61的构建
目的:构建N-ras基因第61位密码子突变基因(N-ras/61)的重组痘苗病毒,通过痘苗病毒载体所产生的蛋白的强烈免疫原性来提高变异N-ras蛋白的肿瘤抗原性。方法:利用双PCR方法得到第61位突变的N-ras/61基因片段(500bp),将该基因片段插入痘苗病毒表达载体P1108,通过Cell FECTIN转染CV-1细胞,以PCR,Western blot方法鉴定重组痘苗病毒。结果:通过tk-筛选、PCR鉴定,得了第61位突变N-ras/61基因的重组痘苗病毒rV-N-ras/61,Western blot检测其在CV-1细胞中有表达。结论:目前对突变ras基因的研究多着重于机理方面,本研究对研制有效的突变ras基因疫苗是一个有益的尝试,其免疫治疗作用有待于进一步研究。
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内皮抑素对小鼠肺腺癌LA795生长和转移抑制作用的初步研究
目的:观察人内皮抑素对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制作用。方法:对重组人内皮抑素高效表达克隆pCX的表达产物进行纯化,得到重组人内皮抑素(rhES)。用亲和层析及胰弹性蛋白酶消化法从过期人血浆纯化得到人血管抑素(hAS)。将接种LA795肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成3组,分别给予rhES,hAS或等体积PBS皮下注射,1次/日,共14 d。观察3组肿瘤生长情况、肺湿重、肺表面转移结节数、动物生存期,分别进行q检验。结果:rhES组及hAS组肿瘤生长缓慢,8d后肿瘤逐渐回缩;肺湿重、肺表面转移结节数明显减少,动物生存期明显延长。结论:rhES与hAS均可明显抑制LA795所致的小鼠实验性肿瘤的生长与转移,延长动物的生存期。
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3,7-二硝基二苯并溴五环盐诱导K562肿瘤细胞凋亡作用研究
目的:研究3,7-二硝基二苯并溴五环盐对人慢性粒细胞红白血病细胞株K562增殖的影响及其凋亡机理。方法:采用台盼蓝拒染法,MTY比色法及克隆形成率等方法,并用光学、荧光及电子显微镜观察照相,流式细胞术等方法分析DNA断裂的数值。结果:cBr对562具有杀伤作用,可明显抑制K562细胞增殖,呈现时间和剂量效应:克隆形成率测得IC50为0.497 mmol/L,流式细胞术测定凋亡率为70.34%;荧光显微镜和电镜观察到明显凋亡特征。结论:cBr抑制肿瘤增殖是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。
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更昔洛韦对慢性粒细胞白血病细胞生长和分化影响及其机制研究
目的:探讨更昔洛韦(GCV)对人白血病细胞的抗增殖和诱导分化作用。方法:GCV加人K562细胞培养4 d,测定其活细胞数目、克隆形成率、联苯胺染色阳性率,观察光镜形态、组织化学染色,并进行流式细胞分析、端粒酶检测。结果:在GCV的作用下,K562细胞的增殖受抑,生长分数降低,并且向具有合成血红蛋白能力的细胞分化。结论:GCV对562细胞具有抑制增殖和诱导分化作用,该结果为慢性粒细胞白血病(CML)的治疗探索新的途径。
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p53抗原肽及B7重组痘苗病毒抗肿瘤的研究
目的:探索点突变p53抗原肽重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫效应,以及B7对之的加强作用,为重组抗原肽疫苗用于肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法:选择人135位Cys→Tyr点突变p53为肿瘤相关抗原模型,观察包含该点突变p53抗原肽p53125~145的重组痘苗病毒rVV-p53M单独和联合应用表达B7的重组痘苗病毒rVV-B7诱导的CTL及对荷瘤小鼠的免疫保护和治疗效应。结果:以rVV-p53M经静脉免疫BALB/c小鼠能够诱导以CD8+T细胞为主的特异性CTL。rVV-p53M能够保护部分小鼠免遭致死剂量的肿瘤细胞攻击。以rVV-p53M治疗荷瘤小鼠,可显著延长小鼠平均存活时间。rVV-B7与rVV-p53M以1:1的比例混合接种可加强r VV-p53M诱导的抗瘤免疫反应。结论:以痘苗病毒为载体的p53抗原肽疫苗可代替人工合成抗原肽,有潜在的临床应用价值,共刺激分子B7与肿瘤抗原相结合是一种有效的免疫治疗策略。
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异体LAK细胞对白血病患者MDR细胞的体外净化作用
近来研究表明,长期的化疗会导致肿瘤细胞多药耐药(multidrug resistance,MDR)的产生,它与多药耐药基因(MDRl)表达产物,P-糖蛋白(P-glycoprotein,PgP,170 kD),的过度表达有关。淋巴因子激活的杀伤(Lymphokine activated killer,LAK)细胞对新鲜或无耐药细胞研究较多,其明显的杀伤作用已获肯定。已有人进行过LAK细胞对白血病耐药细胞株的体外杀伤研究[1],也有人进行过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测MDR的研究[2]。但是,应用FCM检测异体LAK细胞对白血病耐药细胞的体外净化作用国内外仍无人报道,现报道如下。1 材料与方法1.1 主要试剂、细胞、标本及仪器 RPMI 1640细胞培养液、淋巴细胞分离液(Fi-coll)、白细胞介素-2(IL-2)、MDR-PE(P170单抗)、IgG2a-PE(P170单抗阴性对照)。正常人单采白细胞。白血病骨髓标本:取自复发的或长期化疗的白血病患者骨髓6例,4男2女,19岁~56岁之间,经血细胞形态学确诊。主要仪器:流式细胞仪。1.2 LAK细胞的制备 取正常人单采白细胞20 ml,以无菌生理盐水等体积混合稀释,分数管按2:1(体积比)缓慢加入含有Ficoll的离心管中,2 000 r/min离心25 min后吸取界面层细胞(即单个核细胞),用生理盐水离心清洗3次,调整细胞浓度为l×106,加入1 500 U/ml浓度的IL-2,置于37℃,5%CO2培养箱中孵育4 d即成。1.3 白血病原代细胞悬液的制备 无菌抽取复发的或长期化疗的白血病患者骨髓3ml,肝素抗凝(20/ml),以无菌生理盐水等体积混合稀释,将此骨髓稀释液缓慢加入含有3ml Ficoll的离心管中,2 000 r/min离心20 min后吸取界面层细胞,用生理盐水离心清洗3次,调整细胞浓度为1×105,置于37℃,5%CO2培养箱中培养备用。
关键词: 淋巴因子激活的杀伤细胞 多药耐药 -
人参皂甙与IL-2协同诱导PBMC对恶性脑胶质瘤细胞杀伤活性研究
目的:探索提高恶性脑胶质瘤治疗效果的新途径。方法:用人参皂甙(ginsenoside,GS)与白细胞介素2(IL-2)协同诱导人外周血单个核细胞(PBMC)制成GS-LAK细胞,用MTT法测定其对恶性脑胶质瘤细胞(BT325)的杀伤活性,并与LAK细胞相比较。结果:效应细胞GS-LAK在增殖数量和杀伤恶性脑胶质瘤细胞活性等方面均优于LAK细胞,且IL-2用量减少。结论:采用GS-LAK细胞,可提高效应细胞的数量和活性,为恶性脑胶质瘤的免疫治疗打下了理论基础。
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Ribozyme对癌基因ki-rasG12V mRNA的剪切及其特异性
目的:设计切割ki-rasG12vmRNA的特异性ribozyme(Rz217),明确其对癌基因ki-rasG12VmRNA的细胞内外切割活性,为以ki-rasG12VmRNA为特异性靶分子的基因治疗及癌基因ki-ras的功能研究提拱一种新的途径。方法:依Symons总结的"锤头结构"原理,设计一种能特异性切割ki-rasG12VmRNA的ribozyme,利用DNA重组技术构建ki-rasG12V外显子1和ri-bozyme Rz217的体外转录质粒及ribozyme Rz217的真核表达质粒,体外转录获得ribozyme Rz217及ki-rasG12V外显子1 mRNA,在含Mg2+溶液中ribozyme Rz217对其靶RNA分子进行切割。以RT-PCR对转染ribozyme Rz217真核表达质粒的细胞ki-rasG12VmRNA进行半定量分析。结果:ki-rasG12V外显子1体外转录mRNA分子,能被ribozyme Rz217定点切割而野生型ki-ras外显子1体外转录mRNA则不被切割;转染ribozyme Rz217的胰癌细胞ki-rasG12VmRNA含量减少,而转染ribozyme Re217的肝癌细胞其内源性ki-ras mRNA含量无明显变化。结论:ribozyme Rz217无论在细胞内外均能剪切突变型ki-ras mRNA(G12V)而且其切割作用为突变型ki-rasG12VmRNA特异性的。
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重组人血管抑素的克隆、表达及活性测定
目的:研究血管抑素(angiostatin)的临床应用价值,将其开发为多肽类药物。方法:以RT-PCR从胎儿肝脏钓取人血管抑素全编码区cDNA,使用Pichia分泌型酵母表达系统表达重组人血管抑素,重组蛋白经肝素亲和层析纯化后,以鸡胚尿囊膜法血管生成实验及小鼠创伤愈合实验检测活性。结果:重组人血管抑素在酵母系统中得到较高量表达(5 mg/L),经肝素亲和层析纯化,SDS-PAGE显示分子量为43 kD。活性实验表明,重组蛋白能够抑制新生血管形成、抑制伤口愈合。结论:重组人血管抑素在酵母系统中实现高效表达,并具有很好的生物学活性。
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MAGE3-HLA-A2肽疫苗诱导胃癌患者自体CTL的研究
MAGEs(melanoma antigen genes)基因家族是由T.Boon领导的研究组首先在黑色素瘤细胞系MZ2-MEL中发现的。其基因产物被证实为是第一个人类肿瘤排斥抗原[1]。除了睾丸和胎盘外,MAGE基因在正常组织中均不表达,但在黑色素瘤、头颈肿瘤、肺癌、乳腺癌、消化道肿瘤中均有表达。DCs(树突状细胞)是存在于白细胞中少数具有将抗原递呈给CTL细胞功能的免疫细胞。从MAGE基因产物筛选的抗原肽,在β2M微球蛋白存在下和HLA分子结合,形成抗原复合物,由DCs递呈给CTL细胞,被CTL细胞表面TCR受体识别和结合,激活特异性CTL的杀伤性。MAGE肽疫苗和DC细胞诱导的CTL特异性免疫治疗被视为目前有临床应用价值的方法。消化道肿瘤是我国高发肿瘤病种,本研究组对MAGEs,CEA等作为消化道肿瘤患者免疫治疗靶抗原的应用价值进行分析研究。本文用从MAGE3基因编码蛋白中筛选出能结合HLA-A2的一段九肽作为疫苗,诱导消化道肿瘤患者DC细胞,分析了消化道肿瘤患者MAGE3基因表达的分布,HLA I类抗原位点的分布,比较了非特异性杀伤和DC细胞诱导CTL特异性杀伤的不同,对评估MAGE3-HLA-A2肽疫苗对消化道肿瘤患者免疫治疗研究提供参考。1 材料与方法1.1 病例来源、主要疫苗、试剂、细胞 本实验组152例实体瘤患者,其中,消化道肿瘤(135例)、胃癌(108例);MAGE3-HLA-A2肽疫苗(FLWGPRALV)BACHEM AG;HLA分型试剂盒购置于北京中日友好医院;MAGE3基因检测RT-PCR试剂盒(日本TAKARA公司);RNA提取试剂Trizol(Gibcobrl Life Technologies公司);rhGM-CSF(哈尔滨里亚哈尔生物制品有限公司);rhIL-4(日本Genzyme公司);CD86,CD40,CD14单克隆抗体(丹麦DAKO公司);MTF试剂盒(宝灵曼);靶细胞系Mel-526(表达MAGE3-HLA-A2)由Dr Takesako惠赠。
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131I-人源抗HBs Fab在裸鼠人肝癌模型定位的研究
目的:在人源抗HBs Fab表达载体构建、抗体片段表达及纯化成功后,进行放射免疫显像研究,以评价其在动物模型中的免疫导向活性。方法:用131I标记人源抗HBs Fab,经腹腔注射l,3,5,7 d后行裸鼠人肝癌模型放射免疫显像,于第7天作组织分布测定,并以鼠源抗HBsAg单抗为对照进行比较。结果:实验组在标记抗体注入后第3天即获阳性显像,第5天更加清晰,此时人源抗HBs Fab、鼠源单抗及无关Fab的瘤/肝放射性比值分别为5>4,4>0和0>9。结论:人源抗HBs Fab具有良好的导向活性,为其用于肝癌的导向治疗提供了实验依据。
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HE2/neu肽诱导BALB/c小鼠产生特异性CTL及其抑瘤作用的研究
目的:探讨来源于HER2/neu原癌蛋白的多肽诱导特异性细胞免疫应答及其在体内的抗癌效应。方法:利用合成的2个具有小鼠H-2Kd分子结合基序的HER2/neu肽作为肿瘤排斥抗原,在体外刺激小鼠脾淋巴细胞以及皮下免疫小鼠,观察淋巴细胞的增殖能力、CTL的杀伤活性以及HER2/neu肽的抑瘤作用。结果:HER2/neu肽在体内和体外对BALB/c小鼠淋巴细胞的增殖都有明显的促进作用。HER2/nen肽免疫BALB/c小鼠后,可以从小鼠淋巴细胞中诱导出肽特异性CTL,这些CTL可以特异地杀伤HER2/neu阳性SP2/O细胞,而对HER2/neu阴性SP2/O细胞却无明显的杀伤活性。SP2/OHER2细胞在HER2/neu肽免疫小鼠体内的生长受到抑制。结论:研究结果表明HER2/neu肽可以起到一定的抑瘤保护作用,提示,肿瘤特异性抗原来源的MHC-Ⅰ类分子肽表位作为疫苗进行肿瘤免疫治疗是可行的。
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IL-6受体在人白血病细胞膜上的表达及亲和力
目的:研究各种白血病细胞膜IL-6R的表达、密度及亲和力,为深入探讨对IL-6/IL-6R系统介导IL-6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞的敏感性提供可靠依据。方法:采用放射性配基结合实验(RBA)并结合Satchard作图法,系统分析IL-6R在8种极具代表性的人类白血病细胞系U937,HL-60,KG1,TF1,K562,CEM,HUT28和Raji上的表达密度及亲和力,同时应用流式细胞术(FACS)检测IL-6R的α和β亚单位蛋白在这些白血病细胞上的表达。结果:RBA表明,粒、单、红白血病细胞系HL-60,U937,KG1和TF1表面存在着高亲和力IL-6R,平均IL-6R密度/细胞分别为2 502个,2 874个,2 319个及9 329个,而淋系白血病细胞系CEM,HUT28和Raji以及慢粒K562细胞系则未测到IL-6R。FACS显示,HL-60,KG1,U937和TF1均高表达IL-6R的α亚单位蛋白,而CEM,HUT28及K562则不表达IL-6Rα亚单位蛋白;IL-6Rβ亚单位蛋白在U937,KG1,TF1,HUT28及CEM中呈阳性表达,而在HL-60,Raji和K562细胞中则为阴性。结论:鉴于粒、单、红白血病细胞异常高表达IL-6R,而淋系和慢粒白血病呈阴性表达这一事实,提示急非淋白血病可能更适合用重组IL-6-PE40外毒素融合蛋白进行IL-6/IL-6R介导的靶向治疗。
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大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因系统的体外杀瘤研究
在肿瘤自杀基因的研究中,基因转染效率低下以及旁杀伤效果差,是人们面临的两个主要难题。大肠杆菌DeoD基因产物(嘌呤核苷磷酸化酶PNP)与哺乳动物嘌呤核苷磷酸化酶的区别在于它们的底物专一性不同,它能催化几种无毒的脱氧腺苷类似物转化为剧毒的腺嘌呤类似物。研究发现[1],用大肠杆菌PNP基因的真核表达载体转染人结肠癌细胞系,虽转染效率不到1%,当给予前体药6-甲基嘌呤-2'-脱氧核糖核苷(6-MPDR,脱氧腺苷类似物,为大肠杆菌PNP的底物)后,则导致几乎所有周围细胞的死亡。这些结果表明,PNP/6-MPDR已经成为一个新型的自杀基因系统,而且它的旁杀伤作用是其它自杀基因系统无可比拟的,这就极大地弥补了转染率低下的不足。本文在构建了自杀基因载体pcDNA3-PNP的基础上[2],进一步在体外证实了PNP/6-MPDR自杀基因系统的功能,为以后研究PNP/6-MPDR自杀基因系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株及质粒E.coli Top10;自杀基因载体pcD-NA3-PNP,本实验室构建[2]。
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重组IL-2痘苗病毒表达载体pMJ601的构建与鉴定
IL-2的全身大剂量用药虽能产生有效的抗肿瘤作用但毒性反应严重而限制了它的临床应用[1,2]。随着基因治疗技术的发展,肿瘤的基因治疗尤其是免疫基因治疗已成为引人注目的领域,被认为是肿瘤生物治疗较有潜力的策略之一。基因治疗的方法使肿瘤局部释放IL-2[1~3]可避免上述危及生命的并发症。近年来,众多研究已用ex vivo和/或in vivo法IL-2基因治疗消化道肿瘤如结肠癌[1,4]、肝细胞癌[2]和胰腺癌[3]。要使肿瘤细胞局部分泌高浓度的IL-2,需构建高效表达IL-2基因的载体系统。为此,我们构建重组hIL-2基因的痘苗病毒表达载体,pMJ601hIL-2,为进一步实施胃癌的基因治疗作必要的准备。1 材料与方法1.1 质粒及主要试剂 痘苗病毒表达载体pMJ601由Dr.Bernard Moss (NIH,USA)馈赠。克隆有hIL-2基因的质粒pBlue-scriptⅡSK+/-由陈诗书教授(上海第二医科大学人类基因治疗研究中心)馈赠。BamH I,HindⅢ限制性内切酶,美国GIBCOL公司产品。T4 DNA连接酶(T4DNA Ligase),英国Biolabs公司产品。宿主菌DH5ct由复旦大学遗传所提供。质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒均购自华舜生物工程有限公司。PCRMarker购自华美生物制品公司。1.2 方法1.2.1 hIL-2与pMJ601的连接反应 克隆有hIL-2基因的质粒pBluescriptⅡSK+/-酶切后作琼脂糖凝胶电泳,从Agarose胶中回收hIL-2片段。建立20μL反应体系:无菌水5μL+T4 DNA BUF2μL+BamH I-HindⅢ双酶切pMJ6012μl+hIL-2 10μ1+T4 DNA连接酶1μl。擦入"漂"内,置14℃~16℃恒温瓶内过夜。
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人CD34分化抗原转录调控序列的克隆与调控表达
目的:克隆有特异调控活性的人CD34基因5'端转录调控序列。方法:根据已知的CD34抗原基因5'-端启动子调控序列,自行设计2对引物,用巢式-PCR方法从染色体DNA中成功的克隆661 bp长度的CD34抗原转录调控序列(CD34TRS),CD34 TBS片段插入启动子报告质粒pEGFP-1,观察重组质粒pCD34 EGFP在造血系细胞和非造血系细胞中的调控表达作用。结果:经限制性内切酶酶切鉴定及DNA序列分析证实,克隆的CD34启动子序列与文献报道的顺序基本一致,能特异调控EGFP基因在造血细胞系细胞K562中表达。结论:所克隆的人CD34分化抗原转录调控序列有特异调控真核基因表达作用,本研究为构建造血干细胞特异性表达载体奠定了基础。
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变构蛇神经毒-小鼠腹腔巨噬细胞释放一氧化氮的影响
变构蛇神经毒(modified dotoxified neurotoxin,MN81)是用氧化修饰法,氧化修饰眼镜蛇和银环蛇毒素得到的运动神经元病治疗药物。本文探讨MN81对小鼠腹腔巨噬细胞释放一氧化氮的影响,现将结果报告如下。1 材料与方法1.1 实验动物 BALB/c小鼠,雄性,体重20±2 g购自军事医学科学院实验动物中心(动物许可证号:军医动字95012)。1.2 药品及试剂脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)(Sigma产品);RPMI 1640培养基(GIBCO产品);N-1-萘乙二胺盐酸盐(分析纯)、磺胺(分析纯)(北京芳草医药化工研制公司);其它均为分析纯试剂。 MN81注射液:医院制剂,批号为20000107;规格为l mg/2ml;以10%小牛血清RPMI 1640培养液将该注射液稀释至实验用浓度。1.3 标准曲线的制备精密称取NaNO2 6.9 mg,加水至100.Oml(1mmol/L),分别精密吸取1 mmol/L NaNO2液0.5,1.0,1.5,2.0 ml,加水至10.0ml(50,100,150,200 nmol/L);各液100μl,加Griess试剂(含1%磺胺、0.1%N-1-萘乙二胺盐酸盐、2.5%磷酸)100μl,室温放置10min,在酶标仪(∑960)上490 nmol/L处测定各孔吸收度值;以浓度值(C)为横座标、相应的吸收度值(A)为纵座标绘制标准曲线。结果为:C(nmol/L)=210.2293A+1.0240.r=0.9999。
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二氟甲基鸟氨酸对K562细胞生长特性的影响及其与端粒酶活性的相关性
目的:研究二氟甲基鸟氨酸(DFMO)对K562细胞生长特性、凋亡及端粒酶活性的影响。方法:采用细胞计数、形态观察、FCM分析及DNA电泳分别检测DFMO处理的细胞生长速率、周期分布及细胞凋亡。按TRAP法对细胞端粒酶活性进行检测。结果:DFMO处理的细胞生长速率明显减慢;G1期细胞增多而S期细胞减少;细胞表现凋亡诱导,且其端粒酶活性受到抑制。结论:DFMO引起的K562细胞生长抑制及凋亡诱导与端粒酶活性抑制有关。端粒酶的失活是抑制多胺生物合成的抗癌分子机制重要事件之一。
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联合应用bcr-abl融合基因反义寡核苷酸与c-myb基因反义寡核苷酸对K562细胞作用的研究
目的:研究联合应用bcr-abl融合基因硫代磷酸反义寡核苷酸(Aspo)及c-myb基因Aspo对K562细胞作用效果。方法:Aspo与K562细胞共培养后,台盼蓝拒染法计死活细胞数;甲基纤维素半固体培养法培养CFU-K562;流式细胞仪测定细胞P210蛋白表达及细胞凋亡率;RT-PCR半定量检测细胞bcr-abl mRNA;电镜观察凋亡细胞形态学改变。结果:倒置显微镜下观察到联合应用两种Aspo时,浓度各为5 μmol/L组K562细胞仍呈克隆状生长,作用24 h细胞210蛋白表达明显受抑制,表达率<2%;作用120 h细胞生长抑制率为61.7%,P210恢复为25.7%,凋亡率为22.5%。两种浓度各为10 μmol/L组K562细胞生长疏散,作用120 h细胞生长抑制率达92.2%,P210仍未恢复,凋亡率为64.3%,电镜下见细胞呈典型凋亡形态学改变。当两种Aspo浓度各为5 μmol/L及10 mol/L作用48 h时,K562细胞bcr-abl mRNA较空白组下降69.2%~85.3%。结论:联合应用bcr-abl基因Aspo及c-myb基因Aspo对K562细胞的抑制作用具有一定的协同性,可增强其抗白血病效果。
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γ-干扰素在肺癌、贲门癌介入化疗中的应用
为了对肺癌、贲门癌患者进行综合治疗,延长患者生存期,我们开展了肺癌、贲门癌供血动脉支气管动脉、腹腔动脉插管介入化疗。由于介入化疗提高了肿瘤局部的药物浓度,同时具有总用药量少、全身副作用小、持续时间短、见效快等特点,因此,较静脉给药更为有效。在动脉插管介入化疗的基础上,1993年12月至1996年8月,在对74例110次动脉插管化疗药物灌注中,运用了第二军医大学医学生物技术和分子遗传研究所生产的γ-干扰素[批准文号:(95)卫药试字(沪克隆)S-01号]。全部患者在该治疗中均安全,通过2年随访显示,介入化疗和γ-干扰素运用可延长肿瘤患者的生存期,γ-干扰素可以安全运用于介入化疗。1 材料与方法1.1 临床资料 肺癌、转移性肺癌行左右支气管动脉插管化疗32例48次;贲门癌或伴转移性肝癌行腹腔动脉插管共42例62次。其中男性患者55例,女性19例,年龄在34~81岁,平均60岁±16岁。32例肺癌患者中,手术证实,15例淋巴结转移,8例存在其它脏器转移。手术病理:原发性腺癌17例,小细胞癌3例,鳞癌9例,转移癌3例。贲门癌42例中未手术3例,手术病理:1例为平滑肌肉瘤,余38例均为腺癌。其中23例有淋巴结转移,18例有脏器转移。
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JAKs在ALL骨髓淋巴细胞中的表达和活化
JAKs(janus kinase/just another kinase)是由JAKL~3,TYK2四个成员构成的一个家族,属于非受体型酪氨酸蛋白激酶,是细胞因子受体介导信号传导途径中的重要信号分子,由细胞因子诱导的细胞因子受体复合物活化。广泛参与了淋巴细胞的发育、阳性、阴性选择、分化成熟和功能维持[1]。其缺陷或异常活化与多种疾病,特别是造血系统和免疫系统疾病,密切相关。通过体外培养的白血病细胞株和病毒转化的淋巴细胞研究表明,在不同的白血病细胞株和病毒转化的淋巴细胞中有JAKs家族不同成员的异常活化,而且用相应的JAKs阻断剂能有效地抑制白血病细胞和病毒转化淋巴细胞的生长并诱导其凋亡[1,2]。但未见有关JAKs在ALL患者骨髓淋巴细胞中表达和活化情况的报道。1 材料与方法1.1 材料 JAKs抗体(兔抗人JAK1~3和TYK2多克隆抗体)、抗酪氨酸磷酸化抗体(抗P-Ty,能特异性结合JAKs上磷酸化的酪氨酸)、Protein-A-Agarose beads(美国Santa CrUS公司);Western blot药盒(德国BM);骨髓淋巴细胞:临床经流式细胞仪确诊、未经化疗的急性淋巴细胞白血病(ALL)病人(华西医科大学附属第一临床医院血液科提供)和1例正常献血员(自愿)的骨髓4~5ml,用淋巴细胞分离液常规分离淋巴细胞,液氮冻存备用。
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树突状细胞与免疫耐受的研究新进展
树突状细胞(dendritic cells)作为功能强的抗原递呈细胞(antigen-presenting cells)在免疫应答反应中起着关键作用。其不仅连接着非特异性先天免疫反应与特异性获得免疫反应,调节T细胞和B细胞应答,而且在免疫耐受的诱导和调节中亦起重要作用,例如在胸腺内参与T细胞阴性选择,在外周诱导T细胞凋亡或失能,产生耐受状态。在移植物诱导免疫耐受中,DC的作用愈来愈受到重视。
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乙酰肝素酶与肿瘤转移
乙酰肝素酶是一种内源葡萄糖醛酸酶,与肿瘤转移密切相关,近3家实验室独立地克隆出其基因,为研究肿瘤转移开辟了一个很有潜力的领域。随着有关乙酰肝素酶分子生物学特性、调节因素、抑制剂等方面研究的不断深入,乙酰肝素酶很可能成为抗癌药物的靶子。
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肿瘤抗血管生成治疗研究进展
肿瘤的生长和转移有赖于血管生成。抗血管生成治疗以血管内皮细胞为靶向,通过对抗肿瘤血管生成,切断肿瘤的供养,从而遏制肿瘤的生长和转移,其方法主要包括抑制或中和血管生成因子、应用血管生成抑制剂和针对特异性标记物应用素或抗体攻击肿瘤血管内皮细胞,它具有高效性、特异性、不易产生耐药和毒副作用小等优点。迄今,包括Endostatin和An-giostatin在内的多种抗血管生成药物在抗肿瘤实验研究中取得良好效果,并已开始走向临床。
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几种脂质体及其转铁蛋白复合物对肺癌细胞系转基因效率的比较研究
目前,体细胞基因转移载体包括两大类:一是病毒载体介导的基因转移;另一是非病毒载体介导的基因转移。本次实验研究主要通过对比观察SA脂质体、Escort脂质体及其转铁蛋白复合物对肺癌细胞系A549的转基因效率。实验分组:①对比观察Escort脂质体、SA脂质体及Es-cort-饱和转铁蛋白复合物介导的转基因效率:空白对照组(实验过程中不加DNA、脂质体或其复合物);单质粒组(只加入pCMVβ-Gal);质粒+SA脂质体组(pCMVβ-Gal:SA=1:10,w/w);质粒+Escort脂质体组(pCMVβ-Gal:Escort=1:10,w/w);质粒+Escort-转铁蛋白复合物I组(pCMVβ-Gal:Es-cort:饱和转铁蛋白=1:10:10,w/w);质粒+Escort-转铁蛋白复合物Ⅱ组(pCMVβ-Gal:Escort:饱和转铁蛋白=1:15:15,w/w);质粒+Escort-转铁蛋白复合物Ⅲ组(pCMVβ-Gal:Es-cort:饱和转铁蛋白=1:20:15,w/w);质粒+Escort-转铁蛋白复合物Ⅳ组(pCMVβ-Gal:Escort:饱和转铁蛋白=1:15:20,w/w)。②观察转铁蛋白饱和度对转染效率的影响:空白对照组(实验过程中不加DNA、脂质体或其复合物);质粒+Escort脂质体组(pCMVβ-Gal:Escort=1:10,w/w);质粒+Es-cort-饱和转铁蛋白组(pCMVβ-Gal:Escort:饱和转铁蛋白=1:15:15,w/w);质粒+Escort-缺铁转铁蛋白组(pCMVπ-Gal:Escort:缺铁转铁蛋白=1:15:15,w/w)。基因转染:将A549细胞以1×104/孔接种于96孑L培养板,在37℃,5%CO2条件下继续培养24 h;按上述分组进行转染复合物制备;用RMPI1640培养基洗板1次,后加入转染复合物溶液,在37℃,5%CO2条件下持续转染5 h;弃转染液,加入含20%FBS,1μg/ml氢化可的松RMPI 1640培养基,培养48 h;弃培养液,PBS冲洗1次,加入细胞裂解液,使细胞完全破裂;加入含150μmol/L ONPG,20 mmo1/L Tris(pH7.5),450 μmol/L-β巯基乙醇的底物溶液,在室温下反应1 h;加入1 mol/L Na2CO3终止反应,用酶联反应标识仪在405 nm的波长读取吸光值(A值)。应用完全随机资料的方差分析方法及进行各组间的均数比较。以P<0.05为有统计意义。
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Wistar大鼠重组γ-干扰素真核表达载体的构建
细胞因子是调节机体细胞免疫的重要物质。已有实验表明,γ-干扰素可明显提高机体抗肿瘤、抗感染的能力。随着分子生物学及分子遗传学等基础学科的发展,疾病的基因治疗已成为当今研究的热点。构建可供基因转染的真核细胞表达载体,是进行基因转染研究的基础,具有重要的实用价值。本文旨在构建可供调节机体细胞免疫的重组大鼠γ-干扰素真核表达载体,以供基因治疗研究之用。 本研究首先采用RT-PCR的方法获得Wistar大鼠肺部γ-干扰素的目的基因,并进行纯化。引物序列为:Forward 5'CGGAATTCATCCATGAGTGCTACACGC 3':Reverse 5'TAG-GATCCCTCTCTACCCCAGAATCAG 3'。反应条件:95℃ 3min,冰浴。94℃45 s,57℃ 50 s,72℃ 90 s,35循环,72℃ 10min。然后通过双酶切、双粘末端定向克隆的方法构建Wist-ar大鼠重组γ-干扰素真核表达载体。进而采用电穿孔转化方法将重组pLXSN-IFN真核表达载体导人大肠杆菌,转化条件为1.25 kv,25 pF,200 Ω。经含0.5 mg/ml氨苄青霉素LB培养基扩增后,小量提取质粒,并进行电泳和测序鉴定。 质粒小量提取、双酶切后电泳结果可见,重组pLX-SN-IFN双酶切后载体条带,以及释放出的目的基因片段条带。
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白介素6与化疗药物对人肺癌细胞生长影响的研究
肺癌是呼吸系统的恶性肿瘤之一,近年来其发病率、死亡率呈逐年上升的趋势。研究表明,免疫治疗联合化疗不但能提高其抗肿瘤的效应,而且还可提高机体免疫力。 本文检测了白介素6与化疗药物对人肺腺癌细胞A549生长的作用,旨在探讨其抗肿瘤效应的机制及应用价值,以期为临床上肺癌的综合治疗提供实验依据。①材料:重组人白细胞介素6;丝裂霉素c;硫酸长春新碱;氟尿嘧啶。②方法:整个实验设空白组(加培养基200μl),对照组(单细胞悬液100μl+培养基100μL),实验组(单细胞悬液100μl+各种处理因素100μ1)。实验组又分为IL-6组、化疗药物组及联合用药组。人肺腺癌细胞株A549购于中国科学院上海生物细胞研究所,培养于37℃,5%CO2温箱内,培养液为RPMI 1640。采用Mossman等建立的MT法,略加修改。将消化计数的单细胞悬液加入96孔培养板中,细胞浓度为4×105/ml,每孔加入单细胞悬液0.1 ml,药物0.1ml,置37℃,5%CO2培养箱中培养72 h后,每孔加入40μl MTr液(5mg/ml),继续培养4 h后,吸取上清液。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)0.1 ml/孔,振荡10 min,使MTT还原产物完全溶解,用DG-3022A型酶联免疫检测仪测定每孔光密度值(A值),波长定于570 nm,实验重复7次。肿瘤细胞的生长抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100。③统计学处理:结果以均数±标准差(x-±s),实验组与对照组的比较采用t检验,实验组的比较采用单因素的方差分析,组间比较采用q检验。
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新城鸡瘟病毒和IL-2共同激活的单核细胞抗白血病细胞作用的研究
过继免疫治疗是肿瘤生物疗法中为活跃的领域之一。转输单核-巨噬细胞与细胞因子联合应用是过继免疫治疗中比较有潜力的方法。本文采用噻唑蓝(MTY)测定激活的单核巨噬细胞作用后K562细胞活性的方法观察了用新城鸡瘟病毒L系(NDV-L)和IL-2激活人外周血单核-巨噬细胞(MΦ)对K562白血病细胞的细胞毒性作用。 将对数生长期K562白血病细胞调至所需浓度,作为靶细胞。MΦ:随机采取正常10例外周血10~20ml肝素抗凝制成单个核细胞,洗涤2次,以1×106/ml细胞浓度置6孔培养板底,在37℃,5%CO2饱和湿度下贴壁2 h,收集贴壁细胞,以含10%马血清的RPMI 1640培养液调至所需细胞浓度,作为效应细胞。将前述收集的MΦ与NDV(终浓度100活性单位/ml),IL-2(终浓度3 000 U/ml)共同培养一定时间后,加入靶细胞(效:靶=20:1),作用48 h。每孔加入MTY(浓度5 mg/ml)10μl,暗处静置4 h,加入100μl盐酸异丙醇溶解孔内沉淀。应用全自动酶标光度计(BIO-BAD3350,595 nm)测定每孔OD值,细胞毒活性由下列公式计算:细胞毒活性(%)=[1-(A-B)/c]×100,式中A=(K562细胞+单核-巨噬细胞)的OD值;B=单核-巨噬细胞的OD值;c=K562细胞的OD值。
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卵巢癌p16基因异常表达的临床研究
卵巢癌发病率逐渐上升,现跃居妇癌首位,死亡率高,目前尚无早期诊断方法。 p16是一抑癌基因,其产物P16蛋白竞争性地与CDK4,CDK6结合,抑制后者的激酶活性,从而控制细胞的增殖,其异常与肿瘤的进展和不良预后有关。探索其与临床分期、组织学分级及预后的关系,可应用于临床,对卵巢癌早期诊断,提供治疗选择的参考依据,从而改善预后有重要的意义。 为探讨p16抑癌基因与卵巢癌发生、发展及预后的关系。本研究收集1996年1月至1999年6月妇科手术切除卵巢癌36例,病检为卵巢浆液或粘液性乳头状囊腺癌。按FIGO(1985)分期,I期10例,Ⅱ期7例,Ⅲ期17例,Ⅳ期2例。采用PCR及S-P法检测卵巢癌p16基因的状况及表达,应用PCR-SSCP技术检测p16基因有无突变及缺失。p16基因质粒由美国Cool Spring Harbor实验室Beach博士惠赠;PCR试剂盒购自GENF公司。p16抑癌基因引物:5'GGG、GCG、 CGG、 CTG、 GAC、 GTG、 C-3', 5 '-GAG、 GGA、 CCT、 TCC、GCG、GCA、TC-3'配对扩增长度为154 bp;5'-ACA、AGC、TIC、CTI、 TCC 、 GTC 、 ATG、 CCG-3' , 5 '-CCA、 GGC、 ATC 、 GCG、 CAC、GTC、CA-3'配对扩增长度为243 bp。均按试剂盒说明操作,结果与标准质粒PCR-SSCP图谱一致,无突变,如出现丢失,为缺失。应用S-P法检测P16蛋白的表达,p16抗体购自美国Maxim公司,按说明书操作,切片不着色者为阴性(-);瘤细胞淡黄染色<15%为弱阳性(+);瘤细胞深黄或棕黄色染色15%~50%为阳性( );呈棕褐色染色>50%为强阳性( )。结果,卵巢癌PCR-SSCP检测结果与标准p16质粒图谱比较,无明显的突变差异,但有9例缺失,p16基因缺失占25%,卵巢良性肿瘤及正常对照组未检出p16基因突变及缺失。
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恶性肿瘤基因治疗研究的现状与展望
以适当的载体将基因转入体细胞,补充缺失的基因,或使细胞获得新的功能,以达到治疗的目的,即是基因治疗。对单基因变异所致的遗传病,如严重联合免疫缺陷的基因治疗已经有成功的报道。细胞癌变是一个多阶段的复杂过程,涉及多种基因异常。因此肿瘤的基因治疗较难奏效,但可提供多种可选择的方案。基因治疗不是治标而是治本,虽仍存在不少问题需要解决,但在新的世纪里可望出现新的重大突破。1 基因治疗的环节1.1 确定目的基因1.1.1 改变肿瘤细胞的恶性表型 恶性肿瘤有多种基因改变,主要有癌基因(如ras,HER2/neu)的突变、扩增、过度表达,抑癌基因(如p53,rb)的突变、失活,等。针对前者,可采用反义核酸或核酶;针对后者,则可采用野生型的正常基因,作为治疗基因。
年 | 期数 |
2019 | 01 02 |
2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 11 12 |
2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2016 | 01 02 03 04 05 06 |
2015 | 01 02 03 04 05 06 |
2014 | 01 02 03 04 05 06 |
2013 | 01 02 03 04 05 06 |
2012 | 01 02 03 04 05 06 |
2011 | 01 02 03 04 05 06 |
2010 | 01 02 03 04 05 06 |
2009 | 01 02 03 04 05 06 |
2008 | 01 02 03 04 05 06 |
2007 | 01 02 03 04 05 06 |
2006 | 01 02 03 04 05 06 |
2005 | 01 02 03 04 |
2004 | 01 02 03 04 |
2003 | 01 02 03 04 |
2002 | 01 02 03 04 |
2001 | 01 02 03 04 |
2000 | 01 02 03 04 |