V型腺病毒纤维蛋白基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建腺病毒纤维蛋白基因的真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达,为腺病毒靶向性载体构建创造条件.方法:采用限制性内切酶技术,酶切腺病毒骨架质粒pAdEasy-1,经多次亚克隆,后完成克隆纤维蛋白基因并构建其真核表达质粒.用脂质体法将构建好的真核表达质粒瞬时转染COS-7细胞,于转染后72 h,用Western blot法检测所表达的蛋白.结果:克隆成功纤维蛋白基因,并构建纤维蛋白基因真核表达质粒pcDNA/Fiber,经限制性内切酶酶切鉴定及测序证实了其正确性.Western blot结果显示,新表达蛋白在变性条件下大小为62 kD,而在非变性条件下为186 kD.结论:纤维蛋白基因真核表达质粒能在真核细胞中表达,产物具有三聚体结构,可用于腺病毒靶向性载体的构建.

E1B缺陷腺病毒对鼻咽癌CNE-2细胞杀伤作用及其机理研究

目的:研究E1B缺陷腺病毒dl1520对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤作用及其作用机理.方法:用MTT法和细胞病变试验(CPE)测量dl1520在体外对CNE-2细胞的抑制和杀伤作用,并通过测定病毒在CNE-2细胞中的复制产量和DAPI染色试验探讨其杀伤机理;瘤内注射dl1520,观察其对CNE-2裸鼠移植瘤的治疗效果,用免疫织化方法检测肿瘤组织中病毒的复制.结果:体外实验结果显示:dl1520能在CNE-2细胞中复制,导致明显的细胞病变,显著抑制CNE-2细胞的生长,在病变细胞中可见明显的核膨胀;瘤内注射dl1520能明显抑制裸鼠移植瘤的生长,在肿瘤组织中可检测到病毒复制.结论:d11520能在CNE-2细胞中复制并使之裂解,从而在体内外有效地抑制和杀伤CNE-2细胞.

化疗联合重组Endostatin对小鼠种植瘤的治疗作用

目的:了解化疗联合重组Endostatin对小鼠种植瘤的治疗作用,为肿瘤的免疫治疗提供条件.方法:构建小鼠En-dostatin原核表达质粒,在大肠杆菌表达小鼠Endostatin融合蛋白.分离纯化后,与丝裂霉素C联合应用,治疗种植在小鼠腿部肌肉内的小鼠肝癌H22肿瘤.观察瘤重,免疫组化检测肿瘤血管密度和肿瘤坏死情况.结论:单纯应用重组Endostatin治疗种植瘤即产生明显的抑制作用,和化疗合用后,抑制作用更强,肿瘤血管密度减少,肿瘤细胞大量坏死.

淫羊藿甙对急性早幼粒白血病细胞端粒酶活性的影响

目的:探讨淫羊藿甙(ICA)对急性早幼粒白血病细胞端粒酶活性的影响.方法:采用ICA与全反式维甲酸(AT-RA)对比试验,观察ICA对白血病细胞端粒酶活性及增殖分化的影响.结果:ICA可明显抑制端粒酶活性,对白血病细胞均有较明显的诱导分化和抑制增殖作用,且与ATRA合用可产生明显的协同效应.结论:ICA具有抑制急性早幼粒白血病细胞端粒酶活性的作用.

c-myc反义基因对人高转移肺癌细胞增殖和黏附活性的抑制作用

目的:观察c-myc反义基因抑制人高转移性肺癌PG细胞增殖,下调侵袭黏附性的作用和机制.方法:合成c-myc反义寡核苷酸,经脂质体包裹,转导入c-myc高表达的PG细胞中.RT-PCR方法检测c-myc mRNA表达水平的变化,流式细胞术检测c-myc蛋白的表达.MTT法检测细胞增殖活性,黏附实验检测PG细胞的黏附性.结果:c-myc反义基因(＞0.625μmol/L)对PG细胞c-myc mRNA、蛋白表达和细胞增殖活性具有明显的抑制作用,其处理PG细胞72 h后,20～80 min不同时间的细胞黏附百分率,从50.0%,81.27%和90.0%分别显著下降到31.5%,37.5%和30.0%(P＜0.05),下降呈时间依赖效应.结论:c-myc反义基因抑制PG细胞c-myc mRNA和蛋白表达水平,同时下调增殖活性和侵袭黏附性.

重组可溶性KDR及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用

目的:分析可溶性KDR(sKDR)及其抗体对内皮细胞增殖的抑制作用.方法:通过ELISA分析大肠杆菌表达的sKDR纯化产物与VEGF165结合的能力;sKDR免疫家兔制备KDR262抗血清,Wenstem blot分析该抗血清与KDR262蛋白结合的特异性;用3H-TdR掺人法,MTr法和细胞计数3种方法分析重组sKDR及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用.结果:sK-DB蛋白可与VEGF165特异性结合,肝素可增强其结合能力.KDB262抗血清具有特异性识别KDB蛋白的能力,其滴度为1:2 000.用3H-TdR掺入法和MTF 2种方法分析sKDR蛋白及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用结果一致,sKDR蛋白浓度在10μtg/ml,2 vG/ml,0.4μg.ml时对内皮细胞增殖抑制率平均为56%,44%和32%;抗KDR262抗体在稀释度为50,200和800倍时对内皮细胞增殖的抑制率平均为70%,56%和43%.细胞计数法测定结果,sKDR及抗KDR262抗体组与VEGF165单独刺激组,GST和PBS对照组相比,内皮细胞增殖被明显抑制,随浓度增加抑制活性明显增强,但抗体的抑制活性比sKDR蛋白高.结论:大肠杆菌表达的sKDR及其抗体对内皮细胞均具有明显的增殖抑制作用.

化疗药物体内外对免疫活性细胞的影响

目的:通过化疗对机体免疫细胞影响的研究,探讨肿瘤化疗后衔接生物治疗的佳时效.方法:采用细胞培养技术,观察化疗药物对培养的肿瘤细胞、小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞的毒性作用;同时还观察化疗药物作用小鼠体内不同时间后,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞代谢和激活功能的影响;运用细胞计数的方法,观察化疗对小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞的动力学影响;另外对经化疗药物注射2 d后的小鼠进行H22肝癌细胞接种,14 d后解剖小鼠观察肿瘤生长.结果:化疗药物体外对免疫细胞有很强毒性作用,体内使免疫细胞代谢降低,活化受阻,并使免疫细胞动力学发生改变,在化疗后第3天免疫细胞数降至低,约10 d左右恢复正常;化疗药物注射小鼠体内2 d后,再接种瘤细胞,肿瘤生长明显加快.结论:化疗既降低机体免疫细胞数量,又抑制其功能,且在其杀瘤作用消失后还具有间接促瘤生长的作用,因此,化疗后立即实施以肿瘤免疫治疗为主的生物治疗是不恰当的,在化疗后间隔较长时间再给予生物治疗也是不恰当的,生物治疗应选择在化疗药物作用消失后,免疫细胞数降至低或开始恢复时实施,方能取得较好的效果.

同系细胞瘤苗对低免疫原性小鼠黑色素瘤治疗作用的研究

肿瘤的主动特异性免疫治疗(肿瘤疫苗)是极具吸引力的治疗方法.目前虽已相继建立了一系列在动物模型中被证明有效的细胞瘤苗设计方案,但在临床上所取得的疗效大多有限.其中一个重要的原因是人类自发性肿瘤多为低免疫原性,因此,人们力求发展一种佐剂,以增强瘤苗的免疫原性.迄今为止,在所试过的佐剂中仍以BCG优,且制备简单,但BCG可引起人体组织坏死破溃,难以在人体应用.

化疗剂量对肿瘤化疗后衔接生物治疗的影响

目的:探讨化疗剂量对肿瘤化疗后衔接生物治疗的影响,为实施肿瘤化疗+生物治疗联合方案时选择化疗剂量提供依据.方法:以丝裂霉素C(MMC)注射小鼠,确定高低2种不同剂量;采用pCH510质粒转染、Hsp70-肿瘤抗原肽复合物注射、质粒转染+复合物注射3种不同生物治疗方式衔接不同药物剂量的化疗,对H422肝癌细胞接种的小鼠进行治疗,对疗效进行比较.结果:通过MMC的毒性试验确定了100μg为高剂量,50 μg为低剂量.肿瘤化疗后衔接不同方式的生物治疗,均可提高疗效,但高剂量化疗后衔接生物治疗的效果更佳.在低剂量化疗后,给予3种不同生物治疗,它们之间的疗效并没有差别,而在高剂量化疗后,3种不同的生物治疗方式的疗效则出现了显著差异,化疗后同时进行pCH510质粒转染+Hsp70-肿瘤抗原肽复合物免疫注射,效果好.结论:不同的化疗剂量对肿瘤化疗之后进行的生物治疗会产生的影响,在高剂量化疗下,生物治疗和化疗两者联合可以更好地提高疗效.

腺病毒介导反义VEGF降低肿瘤诱导免疫抑制及增强IL-2的抗肿瘤效果

目的:本研究旨在探讨腺病毒介导的反义VEGF降低肿瘤诱导的免疫抑制及增强IL-2的抗肿瘤效果.方法:用反义VEGF修饰及反义VEGF与IL-2基因共同修饰MM45T.Li小鼠肝癌细胞,然后观察修饰后的肿瘤细胞的致瘤性;并在体内观察反义VEGF与IL-2基因诱导肝癌模型小鼠肿瘤细胞的凋亡,以及肿瘤组织中CD4+,CD8+细胞浸润情况.结果:反义VEGF降低了肝癌细胞MM45T.Li的致瘤性;增加了肿瘤组织周围CD4+,CD8+细胞浸润,改善了模型小鼠的免疫抑制状态;提高了IL-2抗肿瘤效果.结论:反义VEGF不仅可抑制新生血管的生成,而且可降低肿瘤诱导的免疫抑制,从而提高免疫系统对肿瘤细胞的识别,与IL-2免疫基因治疗相联合可明显提高对肿瘤的杀伤效果.

可溶性VEGF受体FLT-1克隆、表达及其对血管生成的抑制作用

目的:克隆VEGF受体sFLT-1片段1-3区,并使之在原核中进行表达以探讨其对内皮细胞增殖和血管生成方面的抑制作用.方法:提取脐静脉血管内皮细胞总RNA,克隆sFLT-1基因1-3区,并使之在QIA表达系统进行表达;Ni2+-Sepha-rosee 6B亲和层析纯化、复性.应用MTF和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型,探讨重组蛋白对血管生成的抑制作用.结果:该表达系统能表达sFLT-1基因片段,表达量低.纯化后,经复性,sFLT-1具有与VEGF特异结合功能,1μg重组sFLT-1蛋白能抑制10ngVEGF诱导的脐静脉内皮细胞增殖和20 ng VEGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成.结论:sFLT-1基因片段能在QIA表达系统中得到表达,复性后重组蛋白具有与VEGF结合和拮抗VEGF生物学活性的功能.

肿瘤坏死因子联合化疗药物抗Walker-256肿瘤细胞的研究

目的:研究重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)及其联合化疗药物的体外杀伤肿瘤细胞的作用.方法:采用体外细胞毒方法(MTT)及流式细胞仪分析法检测重组人肿瘤坏死因子或/和阿霉素(ADM)对大鼠Walker-256肿瘤细胞作用后的细胞毒性及细胞分裂周期各时象的变化.结果:rhTNF有很强的抗瘤活性,与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.01),并有很好的量效关系(γ=0.9811),与ADM联用表现有协同增强细胞毒性;rhTNF使G2、s期细胞减少,增殖指数(PI)降低,与ADM联用,其作用更加显著.结论:rhTNF与ADM联用对Walker-256肿瘤细胞有协同增强的杀伤作用.

体外构建靶向脂质体靶向杀伤肿瘤血管内皮模型

目的:于体外构建靶向脂质体标杀肿瘤血管内皮的小鼠模型并进行验证.方法:利用肿瘤细胞分泌的IFN-y刺激内皮细胞表达MHCⅡ,以连有抗MHCⅡ抗体的免疫载药脂质体靶向杀伤内皮细胞.内皮细胞的MHCⅡ阳性率由细胞流式仪监测.免疫脂质体识别靶细胞的能力由结合实验验证.细胞毒实验采用的是MTF检测法.结果:肿瘤细胞分泌的IFN-y可刺激内皮细胞表达MHCⅡ.内皮细胞SVEC与转染IFN-y基因的神经母细胞瘤C1300(Mu.y)的上清培养2 d后,约有23%的上皮细胞表达MHCⅡ.连有抗MHCⅡ抗体的脂质体可与表达MHCⅡ抗原的内皮细胞特异结合.结合率可达非特异性脂质体的3倍.载药的抗MHCⅡ脂质体可特异杀伤MHCⅡ阳性内皮细胞.结论:免疫靶向脂质体可于体外特异杀伤因肿瘤分泌的细胞因子的作用而呈递抗原的内皮细胞.

榄香烯处理增加肿瘤细胞膜HSP70表达机制的研究

热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是指热应激(或其它应激)时细胞新合成或合成增加的一组蛋白质,它们是细胞内的主要分子伴侣,在细胞的结构维持、更新、修复及免疫等方面发挥重要作用[1].榄香烯复合瘤苗是用中药温莪术抗癌有效成分榄香烯等处理肿瘤细胞制备的,能够诱导比较强的抗瘤主动免疫效应.

热休克蛋白与肿瘤免疫治疗

热休克蛋白(HSP)与肿瘤免疫的关系是近年来的研究热点之一.HSP肽复合物携带有多个T细胞表位,通过与APC细胞上的受体结合而内化,经MHC I类途径诱导特异性抗肿瘤免疫应答.HSP与抗原的融合蛋白也能激活抗原特异性的CTL反应.HSP肽复合物和HSP融合蛋白可用于肿瘤的特异性免疫治疗,临床应用前景广阔.

树突状细胞肿瘤免疫治疗临床应用进展

树突状细胞由于能够刺激并致敏初始T细胞和启动早期免疫反应而被公认为是具潜能的抗原提呈细胞.树突状细胞疫苗的抗肿瘤免疫治疗效果在动物模型中得到了验证,同时人树突状细胞培养的方法也得到了进一步的改进和完善.因而,树突状细胞疫苗的抗肿瘤免疫治疗得以进入Ⅰ～Ⅱ期临床研究.本文就近年来应用树突状细胞疫苗进行抗肿瘤免疫治疗的临床研究中,树突状细胞的获取和培养、树突状细胞的输注途径和剂量、目前临床应用治疗的肿瘤类型和方法以及治疗的疗效及评价指标进行了综述.

ELISPOT技术在抗肿瘤疫苗研究中的应用

在肿瘤疫苗治疗前后,如何准确的定量、定性判定肿瘤抗原特异性T细胞反应,评价疗效,是影响抗肿瘤疫苗发展的关键.ELISPOT法是近年来逐渐建立起来的一种通过检测细胞因子评价T淋巴细胞功能和特异性的新方法.它能够对T淋巴细胞直接进行检测,不需要体外扩增,特异性、敏感性都有所提高.经过可行性分析和多中心对比研究,该技术不仅可用于监测肿瘤疫苗的疗效,也能用来鉴定肿瘤抗原表位.很有可能在完成的与其他方法的比较后ELISPOT将会成为定量分析肿瘤或病毒特异性的T细胞反应的首选.

增殖病毒的临床研究现状及进展

增殖病毒疗法是一种新型的肿瘤治疗手段,该病毒在肿瘤细胞中特异性增殖,从而特异性杀灭肿瘤细胞.目前已经研制成功并已在肿瘤临床研究中应用的增殖病毒包括ONYX-015,CN706,CV787,G207以及一些RNA病毒等.有限的临床研究报告显示该类病毒具有明确的疗效,毒副作用较小,联合常规化疗使治疗效果进一步提高.

沙培林配合NP方案治疗非小细胞肺癌临床观察

NP方案有效治疗非小细胞肺癌屡有报道,但化疗的同时,往往伴有严重的骨髓及免疫抑制.为探讨有效治疗NSCLC的同时减轻化疗毒副作用的有效方法,我们用沙培林[国药准字(1998)鲁亚S-01号]配合NP方案治疗NSCLC,全部病例为确诊的NSCLC,共30例.均为初治,均无青霉素过敏.

HLA表达与肿瘤的生物治疗

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)的主要生物学功能是在免疫应答中参与抗原分子的加工处理和提呈,从而控制免疫应答的发生和强弱.其他功能均由此衍生.肿瘤细胞之所以能逃避机体的免疫监视,同样与HLA的表达及其功能密不可分.本文就HLA表达与肿瘤的关系及其在肿瘤生物治疗中的应用作一论述.

2002年广东省中西医结合肿瘤学术年会暨全国肿瘤诊疗新技术研讨会