腺相关病毒载体介导外源基因导入人外周血干细胞的研究

目的:观察腺相关病毒载体介导外源基因导人人外周血干细胞的转染效率及表达.方法:本文采用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体介导的基因转移方法,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和人多药耐药基因(multi-drug resitance,MDR1)导人人外周造血干/祖细胞,并对转染效率和转基因造血细胞的耐药性进行了初步研究.结果:rAAV/GFP感染CD34阳性细胞后,在荧光显微镜下观察,约30%细胞中可见绿色荧光.将rAAV/MDRI重组病毒感染CD34阳性细胞,经PCR和MTT法证实,导人MDR1基因的CD34阳性细胞对秋水仙素的耐药性与未导人MDR1基因的细胞有明显差异.结论:腺相关病毒载体能有效地将外源基因导入外周血CD34阳性细胞,并可在其中有效地表达.

重组分泌型人PSP94对前列腺癌细胞株PC-3抑制作用的研究

目的:探讨重组分泌型人PSP94(rsHPSP94)对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3生长的作用和作用机制.方法:采用噻唑蓝(MTT)法检测rsHPSP94对PC-3的抑制率.流式细胞仪检测细胞周期分布的变化.结果:rsHPSP94以剂量和时间依赖性抑制PC-3的增殖,流式细胞仪分析表明细胞增殖阻滞在G1期,并出现凋亡.结论:本实验结果表明rsHPSP94通过使细胞阻滞在G1期抑制PC-3细胞的增殖.

基因工程人干细胞因子原核表达、纯化及生物学活性研究

目的:摸索一种适合于中试生产的重组人干细胞因子(recombinant human stem cellfactor,rhSCF)的发酵表达与纯化工艺.方法:研究不同培养基和热诱导时间对rhSCF表达量影响;探索佳纯化工艺和各因素对rhSCF得率和生物学活性的影响.结果:rhSCF工程菌在含甘油、酪蛋白水解物、酵母浸出粉、胰蛋白胨及微量元素的培养基中表达量高.灰度扫描显示热诱导后2 h开始表达,6 h表达量高,目的蛋白约可达菌体总蛋白30%.高表达蛋白经复性后,可用酸沉淀作粗分离纯化,随后用阳离子交换层析分离,纯度达80%,经反相层析去除二聚体后,后用DEAE柱浓缩后并经S200转换缓冲液,终获得纯度＞95%和比活性＞6×105 U/mg的rhSCF制品.结论:成功地建立了注射用rhSCF的中试生产工艺,为随后进行的临床前研究及临床试验奠定基础.

TNP-470联合5-FU抑制结肠癌肝转移的研究

目的:研究血管生成抑制剂TNP-470联合5-FU对结肠癌肝转移的抑制作用.方法:将结肠癌LOVO细胞注入裸鼠脾脏,建立结肠癌肝转移模型.将裸鼠随机分为联合治疗组、TNP-470组、5-FU组和对照组4组.治疗4周后,处死裸鼠,计数肝转移率和肝转移结节数.采用免疫组化SABC法和图像分析系统对肝转移肿瘤组织的微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达进行定量分析.结果:TNP-470+5-FU组和TNP-470组与对照组比较,肝转移率显著下降(P＜0.01,P＜0.01);TNP-470+5-FU组和5-FU组与对照组相比,VEGF表达量明显下降(P＜O.01,P＜0.05);TNP-470+5-FU组和TNP-470组与对照组相比,MVD也明显下降(P＜0.01,P＜0.01).结论:TNP-470与5-FU联合应用具有协同效应,可显著抑制结肠癌的肝转移,为安全有效的抗肿瘤策略.

肿瘤热休克蛋白70对荷瘤鼠Th1型细胞因子表达的影响

目的:研究应用肿瘤来源的热休克蛋白70治疗后荷瘤小鼠外周血中几种主要Th1型细胞因子水平的动态变化,探讨其打破荷瘤机体的免疫耐受、诱导抗肿瘤免疫的机制,为其应用于治疗人类的恶性肿瘤提供有价值的参考依据.方法:细胞培养、蛋白质纯化技术、电泳技术、Western-b1ot法、毛细管电泳、动物实验、ELISA等.结果:肿瘤来源的热休克蛋白70具有明显的抑瘤作用,并且能够诱升荷瘤小鼠外周血中几种主要的Th1型细胞因子(IL-2,TNF-β,IFN-γ)的水平,随HSP70的应用频次增加而逐渐升高,在后治疗的2周后仍未见下降趋势,与对照组相比,差异显著(P＜0.01).结论:肿瘤来源的HSP70对荷瘤小鼠Th1型细胞因子有明确的诱升作用,进而诱导机体产生并维持有效的抗肿瘤免疫效应,该作用是其抗肿瘤免疫效应的一个重要方面.

HSV-tk、重组人IL-2、TNF-α融合基因对喉癌细胞Hep-2杀伤作用的体外研究

目的:观察自杀基因HSV-tk与不同细胞因子基因(IL-2、TNF-α)构建的不同融合基因表达产物对喉癌细胞系的体外杀伤作用.方法:分别构建不同融合基因逆转录表达载体PL(TI)SN,PL(T T)SN,PL(TK)SN,在LipofectAMINETM2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将各重组病毒分别感染人喉癌细胞系Hep-2,G418筛选出抗性克隆,分别命名为Hep/TI,Hep/TT,Hep/TK,以RT-PCR及Southern blot检测各融合基因的整合及表达.通过观察各基因修饰细胞生长状况及GCV杀伤实验鉴定融合基因的表达及杀伤效应.结果:RT-PCR及South-em blot分析证明各重组外源基因在人喉癌细胞系Hep-2中均有整合及表达.Hep/TI,Hep/TK生长速度无明显差别,Hep/TT细胞增殖速度受到抑制.在GCV杀伤试验中,Hep/TI,Hep/TT,Hep/TK均显示出对GCV的高敏感性,其中GCV对Hep/TT的杀伤作用为明显,各基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合,均显示出明显旁观者效应.结论:自杀基因与细胞因子基因共表达体系对喉癌细胞系Hep-2体外杀伤具有协同作用,并且有明显的旁观者效应,可望成为肿瘤基因治疗的新途径.

芦荟对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

芦荟含有多种抗癌成分,同时,芦荟对免疫系统有刺激活性[1].本研究应用芦荟浸出液,观察了其对S180荷瘤小鼠的免疫增强作用及抑瘤效应.

肿瘤细胞分泌物抑制树突状细胞的生成和功能

目的:探讨肿瘤细胞对人单个核细胞源树突状细胞(dendritic cells,DC)的生成和功能的影响.方法:培养外周血单个核细胞源DC,体系中加人人肝癌细胞系H7402,结肠癌细胞系HCT-8及正常人骨髓基质细胞系HFCL的培养上清液,以正常培养体系为对照.应用流式细胞技术检测DC的细胞表面标志及吞噬功能;通过[3H]-TdR掺入法检测DC激活同种异体T淋巴细胞活化的能力.结果:H7402和HCT-8细胞培养上清液作为条件培养的DC,低表达CD1a抗原、共刺激分子(CD86)及MHC-Ⅱ类分子,与对照及基质细胞组比较有明显差异.DC成熟也受到抑制.此外,DC对葡聚糖(Dextran)的吞噬功能下降,对同种异体T淋巴细胞激活的能力较低.结论:肿瘤细胞分泌的某些物质可抑制DC的生成及其相关功能,这可能是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的机制之一.

抗膀胱癌单抗Fab段基因的克隆及表达

目的:克隆抗膀胱癌单抗BDI的Fab段基因并在大肠杆菌中表达.方法:用逆转录-聚合酶链反应技术(RT PCR),从分泌抗人膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆K链和Fd段基因,克隆到Fab表达载体中,在大肠杆菌表达噬菌体抗体和可溶Fab;运用PCR介导的定位点突变改造VH氨基端序列;用ELISA、免疫组化法等进行特异性鉴定.结果:从分泌抗膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆了重链Fd段和κ链基因,在大肠杆菌中获得有抗原结合活性的噬菌体抗体和可溶性Fab的表达,但活性很弱,将VH氨基端序列矫正为亲本单抗原始序列后,明显改善了其活性,通过ELISA、免疫组化及模拟抗体库筛选证实了所获抗体片段的特异性结合及在抗体库技术中的可用性.结论:获得了功能性抗膀胱癌小分子抗体,并再次提示抗体氨基端序列对抗体活性的影响的重要性.

丁胱亚磺酰亚胺增强DAAO/D-Ala系统杀伤K562e细胞作用的研究

目的:研究丁胱亚磺酰亚胺(BSO)增强D-氨基酸氧化酶(DAAO)/D-丙氨酸(D-Ala)自杀基因系统在白血病基因治疗中的作用.方法:应用逆转录病毒转染技术获得稳定表达DAAO的高致瘤性K562e单克隆细胞KDfGC,用PCR、原位杂交对DAAO基因修饰的KDGc进行鉴定.应用MTT法检测D-Ala对BSO预处理过的K~rc细胞的杀伤作用.结果:PCR和原位杂交分析证明DAAO基因已整合至细胞基因组中,并在mRNA水平上表达.D-Ala作用24 h,KDfGc细胞的半数抑制浓度(C50)为10.21 mmol/L,KDfGc+BSO的IC50为7.92 mmol/L,两者的95%可信区间不重叠.结论:BSO可增强DAAO/D-Ala系统杀伤K652e细胞作用.

hTNF-α重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性及体内抗肿瘤研究

目的:研究携带hTNF-α基因的第二代重组腺病毒对人肺腺癌细胞系Ani973的体外生物学特性的影响,探讨重组腺病毒在体内抗肿瘤作用.方法:将携带有hTNF-α基因的重组腺病毒(rAd-hTNF-α)感染人肺腺癌细胞系,通过细胞生长实验、克隆形成实验、流式细胞分析、形态学检查等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用;利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞TNF-α的分泌量;通过肿瘤局部注射rAd-LacZ,rAd-hTNF-α的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用.结果:rAd-hTNF-α经扩增、纯化后,滴度可达1010PFU/ml,在30 MOI时,对Anip973细胞的转染率达90%以上.转染的Anip973肿瘤细胞除表面结构和超微结构有轻微变化外,其生长能力、克隆形成率及细胞周期等无明显变化.24h细胞培养上清TNF-α的分泌量为20 pg/ml细胞.体内实验表明注射rAd-LacZ,rAd-hTNF-α的小鼠肿瘤生长缓慢,体积明显小于对照组(P＜0.05),生存期显著延长.结论:腺病毒介导的细胞因子基因hTNF-α转染的Ani一73肿瘤细胞未见明显变化,而体内实验则有明显的抗肿瘤作用.

抑制人肺腺癌细胞MCT1基因的表达对其增殖、凋亡的影响

目的:研究抑制单羧酸转运蛋白第1亚型(MCT1)基因的表达对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响.方法:用电穿孔法将MCT1反义基因表达载体转染进人肺腺癌A549细胞中,以抑制MCT1基因表达.经G418筛选阳性克隆.用PCR,RT-PCR方法鉴定MCT1反义基因与A549基因组的整合;用分光光度法和生物发光法分别测定细胞内pH(intracellular pH,pHi)、乳酸含量和ATP含量.用原位凋亡试剂盒测定细胞凋亡情况,并接种转染MCT1反义基因的细胞和A549细胞于裸鼠皮下,观察移植瘤的生长.结果:与A549细胞比较,转染MCT1反义基因的细胞pHi降低(P＜0.05)、乳酸显著升高(P＜0.001),ATP含量明显降低(P＜0.05).转染MCT1反义基因的细胞凋亡率明显高于A549细胞(P＜0.01).接种转染MCT1反义基因的细胞移植瘤明显比接种A549细胞的轻且小(P＜0.001).结论:MCT1基因对肿瘤细胞增殖凋亡具有重要的调节作用.

重组人内皮细胞生成抑制因子-Endostation的表达和纯化

目的:利用Pichia pastoris菌株高效表达重组人内皮细胞生长抑制因子(rh-Endostatin),并将其纯化至均质.方法:将构建的菌种Pichia pastoris X33/pLW202扩增后接种至发酵培养基中,诱导表达后收获上清,将上清浓缩后经亲合层析、凝胶层析后得到高纯度rh-Endostatin.结果:从发酵上清中可得到60 mg/L高纯度的rh-Endostatin,经HPLC检测纯度达98%以上.结论:在Pichia pastoris表达系统中,实现了rh-Endostatin的高效分泌性表达.

重组新型白介素-2和凝血酶等联合治疗恶性血性腹水临床观察

消化系统肿瘤占全身肿瘤疾病的一半,多数患者晚期合并腹腔转移,出现血性腹水,严重时导致呼吸困难,影响患者生活质量与寿命.局部化疗虽然有一定疗效,但副作用较大.我科自1997年7月至2001年10月采用重组新型白介素-2(rhIL-2)和凝血酶等药联合治疗恶性血性腹水18例,取得了较好疗效.

趋化因子MCP-3基因和B7基因共转染诱导抗大肠癌主动免疫

目的:探讨趋化因子MCP-3(monocyte chemotactic protein-3)和B7基因共转染诱导抗大肠癌主动免疫的可能性.方法:用脂质体将小鼠MCP-3和B7(B7.1)基因导入小鼠大肠癌CMT93细胞,G418筛选抗性克隆,RT-PCR检测B7和MCP-3的表达,趋化实验检测MCP-3的功能.体内实验观察基因修饰瘤细胞(CMT93/B7+MCP-3)的成瘤性、免疫小鼠后所诱导的针对CMT93的免疫保护及其作为疫苗治疗已形成肿瘤的疗效.结果:RT-PCR检测发现CMT93/B7+MCP-3瘤细胞有B7和MCP-3的表达,而且所表达的MCP-3有良好的趋化活性.CMT93/B7+MCP-3的成瘤性显著下降(P＜0.01).经CMT93/B7+MCP-3免疫的小鼠获得对CMT93的免疫保护(P＜0.05).作为疫苗CMT93/B7+MCP-3能抑制接种早期肿瘤的生长.结论:共转染MCP-3和B7基因能有效诱导抗大肠癌主动免疫,共转染的瘤细胞作为疫苗治疗已形成的肿瘤有一定的疗效.

Herceptin治疗转移性乳腺癌的研究进展

Herceptin是一种针对HER-2/neu原癌基因产物的人源化单克隆抗体,能特异的作用于HER-2受体过度表达的乳腺癌细胞.临床研究已评价了其药代动力学、临床治疗转移性乳腺癌的客观疗效和安全性问题.具有较大的临床应用及推广价值.

以质粒为载体的基因治疗现状

近年来,质粒载体在基因治疗中的应用已引起人们的关注,并取得了很大进展.与病毒载体相比,质粒的优点为:制备简单,快捷,成本低廉,用于基因治疗较安全,并能与其它合成载体联合使用.本文就近年来质粒载体的发展,对质粒的设计,质粒导人机体的方法和途径、体内分布,和质粒抗癌药物的疗效进行了综述.

受体介导的基因转移与基因治疗

基因治疗成功的关键在于将治疗基因靶向性转移到细胞或组织,受体介导的基因转移能满足此要求,很有发展潜力的基因转移方法.然而,要将这种转移方法用于基因治疗,与转移系统有关的万分的化学特性与物理反应,靶细胞的受体表达水平,DNA配体复合物怎样逃逸溶酶体的降解以及包含在复合物中的外源基因的表达等都是至关重要的.本文综述了受体介导的基因转移的基本原理.DNA配体复合物形成的佳条件与性质,影响基因转移与表达的各种因素以及近年来国内外受体介导的基因转移用于基因治疗取得的进展.

抗肿瘤血管生成的新策略--组织因子靶向免疫治疗

一种以组织因子为靶向的免疫结合物(icon),可以选择性地结合肿瘤血管内皮细胞及某些肿瘤细胞异常表达的组织因子,并通过结合Fc受体和补体,启动机体免疫系统以攻击肿瘤血管或肿瘤细胞,与此同时,正常血管内皮细胞因不表达组织因子子而免受损害,是一种具有广谱抗肿瘤免疫治疗的新方法.

热休克蛋白受体的研究进展

热休克蛋白(HSP)肽复合物可以激活肿瘤特异性CTL反应,HSP受体的发现为阐明其作用机理提供了有力的证据.HSP通过与抗原提呈细胞(APC)上的受体结合而内化,经MHC I类呈递途径诱导特异的抗瘤免疫应答.HSP受体具有饱和性、竞争性、特异性.HSP与树突状细胞(DC)上的受体结合后可促使DC成熟、分泌细胞因子和趋化因子并下调DC上HSP受体的表达.

人类NK细胞亚群的分类及意义

NK细胞是功能异质性的群体,其亚群的分类方式至今无统一标准.根据NK细胞的表面标志、分泌细胞因子以及某些功能上的差异将其分为CD56bright和CD56dim,NK1和NK2,A-NK和NA-NK等不同的亚群,这些亚群之间明显存在着表型和功能的差异,对NK细胞的研究有重要参考意义.

阳离子脂质体介导小鼠白细胞介素2基因治疗头颈鳞癌的抗肿瘤作用研究

端粒酶活性、C-erbB-2的表达及对乳癌早期癌变的诊断价值

GPI信号肽序列与B7-1基因的拼接及其真核表达载体的构建和序列分析

抗原肽冲击Angiostatin修饰淋巴细胞对Siha细胞的体内外作用

60 Co照射对肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞增殖的影响

mdr1基因转染小鼠骨髓细胞在化疗中药物耐受量的研究

第7届全国肿瘤生物治疗学术会议纪要