靶向ERCC1 RNA干扰对人肺腺癌细胞顺铂耐药的逆转

目的:探讨利用RNA干扰技术切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-completion gene 1,ERCC1)逆转耐顺铂(cisplatin,CDDP)人肺腺癌细胞A549/CDDP的耐药性.方法:(1)常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的ERCC1-siRNA转染细胞,转染浓度分别为100、200、300 nmol/L,并设空白转染、Lip 转染对照组,观察转染效果.(2)采用免疫组化SABC法及RT-PCR法分别检测肿瘤细胞转染siRNA后ERCC1基因和蛋白的表达.(3)MTT法检测肿瘤细胞耐药指数,观察ERCC1靶向siRNA逆转A549/CDDP细胞顺铂耐药的效果. 结果:(1)Lip 组、siRNA-neg组转染效率分别为(56.38±9.82)%、(63.54±4.87)%,SiRNA-ERCC1①组、siRNA-ERCC1②组、siRNA-ERCC1③组转染效率分别为(43.62±6.08)%、(65.85±9.61)%和(78.93±4.86)%.(2)针对ERCC1的siRNA转染A549/CDDP后,细胞ERCC1 mRNA及蛋白表达均下调,siRNA-ERCC1(300 nmol/L)组效应强,分别下降至(11.19±6.82)%和(20.88±6.57)%(P<0.01).(3)A549/CDDP细胞转染后耐药倍数减为6.05、4.64、2.94,空载体对照组细胞的耐药倍数为9.6.结论:RNA干扰技术封闭ERCC1基因可较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞的耐药性,且呈一定的浓度依赖性;ERCC1基因可作为逆转肺癌耐药治疗的有效靶点.

肺癌细胞致敏树突状细胞疫苗的体内外抗肿瘤作用

目的:研究以NCI-H460肺癌细胞致敏的树突状细胞(Dendritic cells,DCs)疫苗的抗肿瘤作用.方法:将IL-18基因转染的NCI-H460细胞及未转染NCI-H460细胞与DC融合作为转染融合DC组及融合DC组疫苗,以NCI-H460细胞RNA冲击的DC为冲击DC组疫苗,以未冲击的DC为DC组疫苗.以MTT法检测4组DC疫苗刺激T细胞增殖的作用,用ELISA法测定DC疫苗上清液中IL-12 的含量,用LDH法测定DC疫苗对NCI-H460细胞的杀伤作用.裸鼠皮下接种NCI-H460细胞及DC疫苗,观察成瘤时间及裸鼠存活情况;荷瘤裸鼠瘤内注射DC疫苗,比较肿瘤体积.结果:4组DC疫苗均能刺激T细胞增殖,刺激作用强度为转染融合DC组＞融合DC组＞冲击DC组＞DC组;4组均能分泌IL-12,转染融合DC组IL-12的分泌量高于融合DC组,冲击DC组高于DC组;转染融合、融合、冲击DC和DC组疫苗对NCI-H460细胞的杀伤率分别为79.73%、50.68%、35.81%及4.05%.转染融合组裸鼠移植瘤成瘤时间[(12.82±2.85)d]长于冲击DC组[(8.52±1.97)d](P<0.05)和DC组[(8.33±1.63)d](P<0.01);移植瘤内注射疫苗后的肿瘤体积比较,转染融合组＜融合组＜冲击DC组＜DC组.结论:以NCI-H460肺癌细胞致敏的DC疫苗在体外及裸鼠体内均显示了抗肿瘤作用,转染融合DC疫苗抗肿瘤作用强,融合和RNA冲击DC疫苗次之,单纯DC疫苗作用弱.

α干扰素促进急性髓性白血病来源的树突状细胞的成熟分化

目的:研究α干扰素interferon alpha,IFN-α)对不同亚型的急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞来源的树突状细胞(dendritic cell,DC)免疫表型及功能的影响.方法:5例初发AML患者(其中M2 1例、M4 2例、M5 2例)的外周血单个核细胞,在含GM-CSF、IL-4 、TNF-α的无血清培养液中培养11 d,其后加入IFN-?2a (1 000 U/ml)继续培养3 d,获得DC(IFN-AML-DC),光镜下观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞免疫表型,同种异体混和淋巴细胞反应检测DC的免疫功能.结果:所有患者白血病细胞培养14 d后均转化为IFN-AML-DC,与正常人外周血单核细胞由GM-CSF+IL-4+TNF-α培养获得的DC(monocyte-derived DC,MoDC)及AML细胞由GM-CSF+IL-4+TNF-α培养获得的DC(AML-DC)相比,IFN-AML-DC具有典型成熟形态的细胞明显增多,表达CD83+细胞的比例显著增加,HLA-DR、CD86分子的表达水平增高,对同种异体T淋巴细胞的激活能力明显高于MoDC及AML-DC.结论:IFN-α能够促进ML-DC的体外成熟,形成更强的免疫激活能力,为AML的免疫治疗提供更有力的手段.

左炔诺孕酮对人子宫肌瘤细胞体外增殖与凋亡的影响

目的:建立稳定、成功率高的人子宫肌瘤细胞原代培养方法,探讨不同浓度左炔诺孕酮(levonorgestrel,LNG)对体外培养人子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法:分别采用酶解法和贴块法原代培养人子宫肌瘤细胞(uterine leiomyoma cell,UtLMC),以?Actin单抗进行免疫组织化学染色鉴定原代细胞;细胞传代后,加入不同浓度左炔诺孕酮,H-E染色和透射电镜观察细胞的形态学改变,MTT法检测LNG对细胞增殖的调节作用,流式细胞术测定细胞凋亡率,RT-PCR技术分析LNG对人子宫肌瘤细胞凋亡相关基因Bcl-2、IGF-1及Survivin mRNA表达的影响.结果:酶解法和贴块法均成功获得UtLMC,经免疫组化鉴定,纯度达95%以上,并能稳定传12代;5 μg/ml左炔诺孕酮对子宫肌瘤细胞无明显作用,当质量浓度达到10 μg/ml时可显著抑制细胞增殖,并呈时间、剂量依赖;随着药物浓度的增加,细胞凋亡率亦逐渐升高,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05);10 μg/ml和20 μg/ml左炔诺孕酮作用UtLMC后,Bcl-2、IGF-1及Survivin mRNA表达下降.结论:酶解法和贴块法均能获得功能良好的人子宫肌瘤细胞,一定浓度的左炔诺孕酮可抑制其增殖并诱导凋亡,机制与下调Bcl-2、IGF-1及Survivin基因表达有关.

人结肠癌组织中Raf-1的表达及其临床意义

目的:研究Raf-1在人结肠癌组织中的表达与肿瘤血管生成的关系,并探讨它们的临床意义.方法:应用组织芯片技术和免疫组化法检测来自西京医院病理科2005-2006年间的87例结肠癌病例癌区、癌旁区及切缘区组织标本中Raf-1的表达,应用CD34标记的免疫组化法检测微血管密度(microvessel density,MVD);并分析Raf-1表达和MVD与结肠癌体积、转移、分化等病理特征之间的相关性.结果:Raf-1在癌组织、癌旁组织、切缘区组织的阳性率分别为86.47%、37.34%和11.03%,3者比较有显著性差异(P<0.01).癌组织、癌旁组织、切缘区组织中MVD值分别为(61.35±11.60)、(28.34±6.70)和(8.26±3.70),3者有显著性差异(P<0.01).Raf-1表达和MVD与肿瘤大小、转移与否密切相关.结论:Raf-1是调控人结肠癌组织血管生成的关键分子,在癌组织中Raf-1的表达与MVD值成正相关,两者与临床上肿瘤的大小、转移与否密切相关.

淫羊藿苷、黄芩苷联合多柔比星抑制肝癌细胞APRIL表达和逆转肿瘤免疫逃逸

目的:探讨中药单体淫羊藿苷(icarrin,ICA)、黄芩苷(baicali,BAI)联合化疗药多柔比星(doxorubicin,又称ADM)抑制肝癌HepG2细胞增殖诱导配体(proliferation-inducing ligand,APRIL)的表达,进而抑制肿瘤细胞的增殖和逆转肿瘤细胞免疫逃逸的作用和机制.方法:MTT法检测25 μg/ml ICA、200 μg/ml BAI、2 μg/ml ADM以及12.5 μg/ml ICA+1 μg/ml ADM、100 μg/ml BAI+1 μg/ml ADM等5个用药处理组与未用药对照组HepG2细胞的增殖活性;RT-PCR检测APRIL及其受体HSPG、凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平;MTT法检测CD3AK(anti-CD3 antibody induced activated killer cells)对用药处理组和未用药对照组HepG2细胞的杀伤活性.结果:ICA、BAI以及ADM对HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用,且呈时间依赖效应;ICA、ADM、ICA+ADM、BAI+ADM组作用96 h抑制率高,分别为(29.30±6.62)%、(63.60±1.35)%、(99.03±0.10)%、(98.89±0.18)%(均P<0.01).HepG2细胞高表达APRIL及其受体HSPG mRNA.ICA、BAI以及ADM下调HepG2细胞APRIL mRNA以及凋亡相关蛋白bcl-2 mRNA的表达水平.ICA、BAI、ADM以及ICA+ADM、BAI+ADM能增加HepG2细胞对CD3AK细胞杀伤的敏感性,杀伤率由对照组的(30.00±4.50)%分别增加到(97.23±5.11)%、(93.12±9.88)%、(60.45±5.71)%、(43.87±8.2)%、(47.25±2.68)%(均P<0.01);且经CD3AK作用后,HepG2细胞bcl-2 mRNA的表达进一步下调.结论:ICA、BAI联合ADM抑制HepG2细胞APRIL、bcl-2 mRNA的表达,进而抑制肿瘤细胞增殖;同时增强其对CD3AK细胞的杀伤敏感性,逆转肿瘤细胞的免疫逃逸.

FasL基因修饰树突状细胞的抗白血病作用及其机制

目的:选择性去除骨髓移植物中异基因反应性淋巴细胞,特异性抑制移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)并保留移植物的抗白血病(graft versus leukemia,GVL)作用.方法:分别把未经处理的、溶T淋巴细胞处理的和以FasL基因修饰树突状细胞(FasL-DC)处理的3组小鼠骨髓细胞移植物移植给已经接种P815肿瘤细胞的BALB/c受体小鼠,然后观察比较各组小鼠存活情况,并用51Cr释放法检测移植后2个月受体小鼠T淋巴细胞的CTL活性.结果:致死剂量(9 Gy)照射的白血病受体鼠在接受经FasL-DC处理的供体骨髓细胞移植后,生存期显著延长,2个月时生存率为40%,对照组在1个月内全部死亡.51Cr释放法检测证实,FasL-DC处理组的T淋巴细胞对P815细胞保持较强的杀伤活性.结论:转染FasL基因的DC可有效去除骨髓移植物中异基因反应性T淋巴细胞,移植用该方法处理过的骨髓,不但能够有效抑制GVHD的发生,同时也可以保留移植物的抗肿瘤作用.

Bcl-XL siRNA在TRAIL杀伤卵巢癌细胞中的增敏作用

目的:探讨Bcl-XL siRNA在肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)杀伤卵巢癌细胞中的增敏作用.方法:用Bcl-XL siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞,然后联合应用TRAIL蛋白处理该细胞;通过流式细胞术检测细胞的凋亡率,通过锥虫蓝染色细胞计数检测细胞存活情况,通过Western blotting检测细胞中各种凋亡相关蛋白的活化情况. 结果:与对照组相比,经Bcl-XL siRNA处理后,SKOV3细胞中Bcl-XL蛋白的表达显著降低;该细胞的增殖受到明显抑制,在处理96 h后为明显,仅为对照组的43.9%(P<0.05).当Bcl-XL siRNA和TRAIL蛋白联合处理后,SKOV3细胞的凋亡率明显增加,达到32%以上(P<0.05),而细胞计数结果显示联合处理后SKOV3细胞的存活率显著下降,仅为对照组的37.8%(P<0.05).Western blotting结果显示,Bcl-XL siRNA和TRAIL蛋白联合处理后凋亡相关蛋白Caspase-8、Caspase-9、Bid、Caspase-3和PARP明显活化,细胞色素C的释放也显著增加. 结论:Bcl-XL siRNA能显著加强TRAIL蛋白对卵巢癌细胞的杀伤作用,其作用机制可能与激活多种凋亡信号蛋白有关.Bcl-XL siRNA可能成为逆转卵巢癌TRAIL耐药的治疗措施.

Survivin反义寡核苷酸树形分子载体的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:研究聚酰胺(polyamidoamine ,PAMAM)树形分子高聚合物作为survivin反义寡核苷酸(survivin antisense oligodeoxynucleotide,survivin-asODN)载体传递系统的可行性以及对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响.方法:将200 μg/L survivin-asODN和3.66 μg/L PAMAM混合制备PAMAM反义基因复合物,同时制备阳离子脂质体反义基因复合物作为对照.透射电镜观察复合物的形态、粒径,Zeta电位分析仪测定复合物的zeta电位,离心法和紫外分光光度仪测定复合物的包封率、载药率和体外DNA释放速度.将上述两种基因载体复合物转染肝癌SMMC-7721细胞,测定其转染效率;Western blotting检测转染后肿瘤细胞中survivin蛋白的表达;流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡率.结果:成功制备PAMAM反义基因载体系统PAMAM-survivin-asODN.该复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物的粒径[(64.9±9.60 )vs(193.9±32.20)nm,P<0.01],但zeta电位高于后者[(37.7±3.80 )vs(22.6±2.20)mV,P<0.05];两者基因载药率、包封率无显著差异;PAMAM反义基因复合物对DNA持续释放达14 d,但脂质体复合物只持续5 d.PAMAM-survivin-asODN 转染肝癌细胞的效果强于脂质体-survivin-asODN(P<0.05).转染后肝癌细胞siurvivin蛋白的表达显著低于脂质体复合物[(26.80±5.65)vs(36.96±5.89),P<0.05],该细胞的凋亡率显著高于脂质体复合物转染细胞[(60.3±8.25)% vs(48.7±9.39)%,P<0.05].结论:PAMAM作为载体系统能将survivin-asODN高效递送到肝癌SMMC-7221细胞,诱导人肝癌细胞的凋亡.

小干扰RNA抑制宫颈癌Hela细胞株HPV18 E6、E7基因的表达

目的:以人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型E6基因为靶点,研究小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对宫颈癌Hela细胞株HPV18基因组中恶性转化基因E6、E7的抑制作用及对细胞内P53蛋白表达的影响.方法:实验分细胞培养液阴性对照组(阴性对照组),无关序列siRNA对照组(无关序列对照组)及转染HPV18 E6-siRNA实验组(siRNA实验组).设计并合成HPV18 E6-siRNA及无关序列siRNA,转染Hela细胞后,RT-PCR检测转染后48、120 h细胞内HPV18 E6、E7 mRNA的变化,Western blotting检测转染后48 h细胞内HPV18 E7和P53蛋白的变化.结果:siRNA转染Hela细胞的效率约为85%.siRNA转染后48 h,实验组细胞内HPV18 E6、E7 mRNA及E7蛋白含量降低,其含量分别为阴性对照组的33.33%、36.78%及33.84%;实验组细胞内P53蛋白含量增加,其含量为阴性对照组的2.194倍.siRNA转染后120 h,实验组细胞HPV18 E6、E7mRNA含量恢复为阴性对照组的90.91%、101.60%.结论:HPV18 E6-siRNA体外能明显抑制宫颈癌Hela细胞HPV18 E6、E7基因的表达,增加细胞内肿瘤抑制因子P53蛋白的水平.

骨涎蛋白单克隆抗体对亲骨转移乳腺癌细胞与骨基质黏附的抑制

目的:探讨骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)单克隆抗体对亲骨转移乳腺癌细胞(MDA-MB -231-BO)与骨基质黏附的抑制作用. 方法:免疫组化方法检测MDA-MB-231-BO、肺癌细胞SPC-1、大肠癌细胞LOVO、乳腺癌细胞BSP的表达;体外骨基质黏附实验检测肿瘤细胞与骨基质的黏附,以及BSP单克隆抗体对MDA-MB-231- BO细胞与骨基质黏附的抑制;以ELISA法检测肿瘤细胞中生长因子TGF-β1分泌的变化.结果:免疫组化结果表明,MDA-MB-231-F10细胞表达BSP,SPCA-1和LOVO细胞不表达BSP;MDA-MB-231-BO细胞黏附骨基质数明显大于SPCA-1细胞和LOVO细胞(P＜0.01);BSP抗体对MDA-MB-231-BO细胞和骨基质黏附具有特异抑制作用,随着抗体质量浓度升高(25、50、100、200 μg/ml),其抑制率分别为22.1%、35.0%、39.2%、41.9%,抑制率与抗体浓度呈正相关;同时BSP抗体能特异性抑制MDA-MB-231-BO细胞与骨基质黏附所介导TGF-β1的释放.结论:BSP单克隆抗体对MDA-MB-231-BO细胞和骨基质黏附具有特异抑制作用,提示BSP抗体可抑制乳腺癌特异性骨转移.

激光显微切割结合蛋白质组学技术分析DDAH-1在肝细胞癌表达的变化

目的:应用激光显微切割(laser capture microdissection,LCM)结合蛋白组学技术筛查肝细胞癌(hepatocellular carcinoma ,HCC)组织及其癌旁组织的差异表达蛋白,分析二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1,DDAH-1)在肝细胞癌表达的变化. 方法:选取2003-2006年间东方肝胆外科医院原发性肝细胞癌患者的手术切除标本40例.利用LCM技术分离捕获肝癌组织及癌旁组织的肝实质细胞,应用二维凝胶电泳技术(two dimensional gel electrophoresis,2-DE)筛选全部标本共同差异表达频率>80%、差异强度>3倍的蛋白质点;应用电喷雾串联质谱(electrospray ionisation tandem mass spectrometry,ESI-MS/MS)及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)对差异蛋白点进行质谱鉴定分析;采用Western blotting及免疫组化对差异蛋白DDAH-1进行检测. 结果:2-DE筛查获得在肝癌及癌旁组织差异表达的蛋白质点共20个,通过质谱鉴定获得12个蛋白质,其中5个在肝癌组织表达上调,7个下调;这12个蛋白质与细胞代谢、增殖、分化及信号调控相关,其中的DDAH-1是参与调控一氧化氮相关通路的重要酶.Western blotting检测显示,20例标本中16例DDAH-1表达明显升高;免疫组化检测证实,10例标本DDAH-1全部呈强阳性表达. 结论:肝细胞癌组织细胞中筛查到12个差异表达蛋白质,其中的DDAH-1在肝癌组织中表达上调,其有可能在肝癌发生、发展过程中起重要作用.

肿瘤抗原致敏树突状细胞疫苗治疗晚期恶性肿瘤的临床观察

目的:观察肿瘤抗原致敏人树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗治疗各类晚期恶性肿瘤的不良反应,初步观察其治疗疗效.方法:91例非小细胞肺癌、结直肠癌、恶性黑素瘤、肾癌、乳腺癌等晚期恶性肿瘤患者入组,均符合试验的纳入组及排除标准,签署知情同意书,并报医院伦理委员会审查批准.患者单采外周血单核细胞体外培育成DC,用抗原致敏后制备成DC疫苗回输,每周回输1次,3次定义为1个周期.结果:91例患者共接受96个周期疫苗治疗;不良反应主要表现为寒战、发热、肌肉酸痛、皮肤瘙痒、胸闷及一过性全身无力,大部分为自限性;76例进行疗效评价,无完全缓解(complete remission,CR)及部分缓解(partial remission,PR)病例,治疗后稳定(stable disease,SD)31例,进展(progression disease,PD)45例,临床获益率40.8%;85例患者获得随访资料,患者中位达进展时间(median time to progression,mTTP)为2.6个月,生存时间为0.9～30.6个月,中位生存时间为4.5个月,1年生存率为9.2%.结论:肿瘤抗原致敏人DC疫苗治疗各类晚期恶性肿瘤耐受性良好,亦可见临床获益,疫苗临床应用方法有待进一步探讨.

肿瘤相关抗原线粒体蛋白12基因的RNA干扰对HeLa细胞的抑制作用

目的:探讨肿瘤相关抗原线粒体蛋白质12基因(tumor-associated antigen mitochondrial protein 12 gene,TAMP12)表达变化对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用.方法:利用计算机辅助设计并化学合成3对针对TAMP12的siRNA片段,通过脂质体法将siRNA转染于TAMP12高表达的HeLa细胞中,筛选有效的siRNA片段.以RT-PCR、实时定量PCR及流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞TAMP12 mRNA及蛋白表达的变化.以激光扫描共聚焦显微镜(confocal lyser scarning microscope,CLSM)观察双色荧光标记蛋白的亚细胞定位和定量表达.以3H-TdR掺入实验和FCM检测阻断TAMP12基因表达对HeLa细胞增殖和凋亡的影响.结果:CLSM检测显示TAMP12蛋白主要表达在HeLa细胞线粒体中.转染siRNA-TAMP12的肿瘤细胞中TAMP12 mRNA及蛋白的表达显著降低,与对照组对比,抑制率分别为81%和87%(P<0.01);转染细胞的DNA合成受抑制,抑制率达42%(P<0.01);转染siRNA-TAMP12肿瘤细胞的凋亡率由对照细胞的8.14%上升到15.59%(P<0.01).结论:RNA干扰可阻断TAMP12基因的表达,从而对人宫颈癌Hela细胞产生抑制作用.

代谢组学——肿瘤学研究的重要技术平台

代谢组学(metabonomics)是对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的一门新学科,与基因组学、转录组学、蛋白质组学等一起构成系统生物学的技术平台.代谢组学分析技术以磁共振和色谱、质谱串联技术为主,获得的代谢谱数据借助化学计量学工具和模式识别软件进行分析.已报道的肿瘤特异性代谢产物涵盖各类生物大分子的物质代谢,代谢组学从机体的动态代谢途径寻找肿瘤等疾病特异性代谢产物,识别人体疾病代谢状态的差异,从而进行疾病分类和诊断.代谢产物是基因表达的终产物,分析生物代谢图谱型特征更能够揭示基因和表现型之间的关系,以达到监测和推断基因功能的目的,为进一步深入分析肿瘤生物机制提供可能.

溶酶体在细胞死亡中的介导作用

溶酶体作为细胞内消化器官,参与细胞自溶、防御等生物过程.近年来研究发现,溶酶体在死亡信号作用下释放以组织蛋白酶为主的多种水解酶,参与包括自噬及凋亡在内的细胞死亡,这一过程称为溶酶体途径的凋亡.溶酶体膜通透性增加程度是决定细胞死亡类型的重要因素.释放的组织蛋白酶可通过剪切Bcl-2家族蛋白,引起一系列的促凋亡反应,如线粒体膜通透性改变、激活caspase等;还可以反作用于溶酶体促进其通透性改变.肿瘤的侵袭转移伴随着溶酶体功能改变及组织蛋白酶表达增加,溶酶体的这些改变能使肿瘤细胞对死亡途径的敏感性增加.研究肿瘤相关的溶酶体成分及功能改变,可以为肿瘤治疗提供新的思路.

肿瘤淋巴管生成与肿瘤的淋巴道转移

淋巴管在肿瘤转移过程中起着至关重要的作用.近年来发现,在多种肿瘤组织内部也存在微淋巴管,只是处于萎缩状态,肿瘤内淋巴管生成显著影响未发生肿瘤转移患者的存活率.肿瘤内淋巴管的存在与否有赖于特异淋巴管内皮标志物,近年来发现并被认可的主要有VEGFR-3、Podoplanin、Prox-1、LYVE-1等.研究证实VEGF-C及VEGF-D通过活化VEGFR-3对肿瘤淋巴管生成进行调控.VEGF-C的表达可促进瘤周淋巴管增生,促进肿瘤的淋巴结转移,多数人认为可作为患者预后不良的独立指标;VEGF-D不但可诱导肿瘤内的淋巴管生成,而且可导致肿瘤细胞向附近淋巴道播散,其表达水平与淋巴转移及低生存率相关.针对VEGFR-3信号转导系统的抗淋巴管生成治疗,有望成为抗淋巴转移的一个有效途径,而其中每一个环节都可能成为控制肿瘤生长、转移以及治疗肿瘤的潜在靶点.

血管内皮前体细胞与肿瘤血管发生

实体肿瘤的生长和演进依赖于肿瘤血管生成.肿瘤血管生成包括血管新生(angiogenesis)和血管发生(vasculogenesis),内皮前体细胞(endothelial progenitor cells,EPC)参与的肿瘤血管发生在肿瘤血管生成中起主要作用.EPC来源主要包括骨髓来源的EPC、血管壁定留EPC和成体干细胞经血管内皮分化形成的EPC,不同来源EPC参与的血管发生过程在肿瘤血管生成中起重要作用.其中,肿瘤干细胞作为肿瘤血管内皮前体细胞新来源的认识为研究肿瘤血管发生提供了新的思路.

肿瘤干细胞:起源与争论

近年来,随着干细胞理论在肿瘤研究中的广泛应用,人们逐渐认识到在绝大多数癌症中,肿瘤细胞很可能起源于一种肿瘤起始细胞--肿瘤干细胞,它在机体内具有自我更新并形成肿瘤的能力.肿瘤干细胞的存在已在多种肿瘤类型与细胞系中得到证实,并鉴定出相应的分选方法,但人们对它的起源却莫衷一是,干细胞突变、细胞融合、胚胎干细胞残留等都有可能是肿瘤干细胞产生的原因.通过多年对肝癌的研究,笔者提出肝癌干细胞来源的假说:认为干细胞在修复肝炎病毒所致肝损伤的过程中,在病毒与炎症的双重刺激下,干细胞与突变肝细胞之间发生细胞融合、交换,终产生肝癌干细胞.随着相关研究的不断深入,肿瘤干细胞学说在理论与技术上也面临着诸多质疑与挑战,其中有观点认为,干细胞可能只是被趋化至癌变部位并因其可塑性而表现出恶变表型,但并未在实质上参与肿瘤的发生与发展.

人外周血树突状细胞体外稳定、高效培养的新方法

目的:建立稳定、高效的人外周血树突状细胞(dendritic cells,DC)体外培养的新方法.方法:离心获取人外周血白膜层细胞,裂解去除红细胞后获得全部白细胞,贴壁培养1 h获得单核细胞,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1 000 U/ml+ 重组人白细胞介素-4(rhIL-4)500 U/ml,体外培养7 d获得DC,以流式细胞术分析表型,体外混合淋巴细胞反应检测细胞抗原提呈功能.结果:从100 ml全血分离获得具有较好活力的贴壁单核细胞仅需2 h;部分肿瘤患者应用传统分离方法不能获得单个核细胞,用新方法仍能从患者外周血稳定地获得足够数量的单核细胞.新方法培养生成DC的数量为传统方法培养生成DC数量的1.8～2.6倍;其中40%～85%为CD1a+,表达高水平的HLA-DR、CD80、CD86,体外可以强烈刺激同种T细胞增殖.结论:建立了更为稳定的、得率更高的DC体外扩增培养的新方法.

CXCL16基因与红色荧光蛋白pDsRed2-N1融合基因表达载体的构建

目的:构建人趋化因子配体16(CXC ligand 16,CXCL16)与增强型红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16,使CXCL16-RFP融合蛋白在人293T细胞中稳定表达.方法:针对CXCL16基因设计引物,扩增人CXCL16 cDNA,退火后插入含有RFP的表达载体pDsRed2-N1.测序正确的CXCL16和RFP的融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16,经脂质体转染人293T细胞株,G418筛选获得稳定转染的细胞株.荧光显微镜观察细胞转染情况,Western blotting比较转染前后293T细胞中CXCL16蛋白的表达变化.结果:经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实,CXCL16基因已正确插入pDsRed2-N1中RFP基因的上游,获得融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16.空载体pDsRed2-N1和融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16经脂质体转染人293T细胞后,在荧光显微镜下可观察到表达RFP的细胞发出红色荧光,转染效率分别可达95%和85% .pDsRed2-N1/CXCL16转染293T细胞后,CXCL16蛋白的表达水平显著上调.结论:成功构建的pDsRed2-N1/CXCL16融合基因表达载体可在293T细胞中稳定表达CXCL16蛋白,为进一步研究CXCL16在细胞增殖调控中的作用奠定了基础.

肝癌微环境中CD4+CD25+调节性T细胞与T细胞免疫的关系

目的:探讨肝细胞癌组织中CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulartory T cell,Treg)与肿瘤微环境T细胞免疫的关系.方法:对52例肝细胞癌组织和癌旁组织用CD4、CD25双重酶标免疫组化染色和用CD8 EnVision法染色,对癌组织中Treg细胞和CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T比值进行相关性分析.结果:正常肝脏组织中未发现Treg细胞,肝癌和癌旁组织中Treg细胞单个高倍视野平均数分别为(7.6±2.84)、(5.2±1.67),两组比较有显著差异(P<0.01);肝癌及癌旁组织中CD4+T细胞单个高倍视野平均数分别为(18.2±3.57)、(25.9±3.36),两组比较有显著差异(P<0.01);肝癌及癌旁组织中CD8+T细胞单个高倍视野平均数分别为(49.9±6.61)、(49.5±6.43),两组比较无明显差异;肝癌及癌旁组织中CD4+T/CD8+T比值分别为(0.37±0.08)、(0.53±0.09),两组比较有显著差异(P<0.01);肝癌组织中Treg细胞的数量与其浸润性CD4+T淋巴细胞的数量及CD4+T/CD8+T比值呈显著负相关(P<0.01),而与浸润性CD8+T淋巴细胞的数量分布无明显相关性.结论∶ Treg细胞在肝癌微环境中可能通过抑制CD4+ T 淋巴细胞的增殖来抑制肿瘤局部免疫.

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