细胞骨架及相关蛋白在人牙周韧带细胞成骨分化过程中的表达模式
摘要： 目的 探讨人牙周韧带细胞(PDLCs)成骨分化过程中细胞骨架及相关蛋白的表达模式及其可能的功能作用.方法 酶消化法培养PDLCs,免疫细胞化学染色检测vimentin的表达;取诱导前(对照组)及矿化诱导7、14和21 d的PDLCs,实时荧光定量RT-PCR检测vimentin、actin、caldesmon(CaD)、tropomyosin(Tm)和 annexin A4 mRNA的表达变化并进行统计分析,Western blot检测蛋白表达.结果 PDLCs表达丰富的vimentin;Vimentin、actin、CaD和Tm mRNA的表达在诱导7 d组下调,诱导14 d组和21 d组逐渐上调;Annexin A4 mRNA的表达在诱导7 d组表现为上调,诱导14 d组和21 d组逐渐下调;Vimentin的mRNA表达在各组间差异均有统计学意义(P ＜ 0.05);CaD和Tm在诱导7 d组与14 d组之间的mRNA表达差异无统计学意义(P ＞ 0.05),其余各组间差异均有统计学意义(P ＜ 0.05);Actin和annexin A4在对照组与诱导21 d组之间的mRNA表达差异无统计学意义(P ＞ 0.05),其余各组间差异均有统计学意义(P ＜ 0.05);Western blot检测蛋白表达显示类似的表达趋势.结论 在PDLCs成骨分化过程中,一组细胞骨架及细胞骨架蛋白相关蛋白呈现相似的表达变化,提示其参与调节PDLCs成骨分化.
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凝溶胶蛋白gelsolin对人牙髓细胞增殖及迁移的影响
目的：研究凝溶胶蛋白gelsolin（GSN）对人牙髓细胞（hDPC）增殖及迁移的影响。方法激光共聚焦检测gelsolin在hDPC中的表达。以小干扰RNA（siRNA）沉默hDPC中的gelsolin， CCK?8法检测细胞增殖；流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期；Transwell实验观察细胞的迁移情况。采用单因素方差分析数据。结果激光共聚焦显示gelsolin普遍表达于hDPC胞浆。沉默gelsolin，hDPC的增殖率在24、48、72 h时分别下降47.8%（F=6.182，P=0.035）、48.9%（F=5.520，P=0.044）、64.1%（F=15.440，P=0.004）；流式结果显示干扰gelsolin，hDPC的凋亡率增加约4.5%（F=21.162，P=0.002），而细胞周期未发生明显阻滞，S期细胞比例升高约5%（F=4.526，P＞0.05），G1期细胞比例下降约8%（F=4.743，P＞0.05）；Transwell结果显示，24 h内hDPC的迁移能力降低约60%（F=12.781，P＜0.001）。结论 gelsolin对hDPC的增殖及迁移具有调控作用。
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变异链球菌ldh-luc荧光报告株的生物学活性检测
目的：探讨本课题组前期所构建的变异链球菌（S.mutans）ldh-luc荧光报告株在浮游态及生物膜状态下的活性及代谢状态的有效性，为探讨抗菌剂对多菌种生物膜中S.mutans的作用提供研究基础。方法采用生长曲线、扫描电子显微镜、活菌菌落计数等方法研究浮游态及生物膜状态下S.mutans ldh-luc荧光报告株的生长活性及代谢状态，并测定荧光报告株的荧光活性。结果 S.mutans ldh-luc荧光报告株和野生株生长趋势一致，生物膜内可培养活菌数无差别（4h：F=2.13，P＞0.05；12 h：F=1.45，P ＞0.05；24 h：F=2.72，P ＞0.05；48 h：F=1.85，P ＞0.05），SEM检测结果显示4、12和24 h生物膜形成能力无差异；S.mutans ldh-luc荧光报告株从对数生长早期到平台早期荧光表达稳定，荧光量能实时反映活菌数量。结论 S.mutans ldh-luc荧光报告株和野生株生长能力相似，具有稳定的荧光活性，荧光量能准确反映细菌活菌数量，提示可用S.mutans ldh-luc荧光报告株代替野生菌株进行相关实验研究，并可用于实时观测抗菌剂对其的作用。
关键词： 变异链球菌 ldh-luc荧光报告株 生长曲线 生物膜 荧光活性 -
定量缓释基因重组碱性成纤维细胞生长因子/聚乳酸-聚羟基乙酸植入片的制备及体外释药研究
目的 制备基因重组碱性成纤维细胞生长因子/聚乳酸-聚羟基乙酸(rbFGF/PLGA)定量缓释植入片,观察其一般性质、体外释药特性和rbFGF生物活性维持情况.方法 溶剂挥发法制备rbFGF/PLGA植入片,用ELISA双抗体夹心法测定植入片中rbFGF含量,进行体外释药试验,检测rbFGF释放速度和含量,并将植入片植入兔下颌牵张成骨区局部缓慢释放观察rbFGF活性.结果 rbFGF/PLGA植入片表面光滑平整,质地均匀,rbFGF含量为3.613 μg/片.标准曲线方程为C＝1280.54A-99.21(n＝7,r2＝0.9952),线性范围15.6 ～ 1000 pg/ml.植入片体外第1天释放rbFGF 10.70%,第9天累积释放51%,第20天释放达到80%以上.兔下颌牵张成骨实验结果显示植入组新骨形成速度和质量均优于对照组.结论 rbFGF/PLGA植入片制备工艺良好,植入片中rbFGF生物活性保存良好,具有定量缓释作用并能促进牵张成骨中新骨形成的速度和质量.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 聚乳酸-聚羟基乙酸 牵张成骨 -
siRNA沉默小鼠原代成骨细胞LIMK2基因的实验研究
目的 探讨采用RNA干扰抑制原代成骨细胞中LIMK2的表达及其抑制效率,为进一步研究LIMK2基因的作用奠定基础.方法 针对小鼠LIMK2基因,化学合成3条siRNA,分别编号为R1、R2、R3,用脂质体分别介导转染到小鼠原代成骨细胞中,转染后24、48 h提取细胞的总RNA和总蛋白,分别进行RT-PCR和Western blot检测,研究3条siRNA 在不同时间点对LIMK2基因的抑制效率.结果 RT-PCR结果 显示编号为R3的siRNA对LIMK2 mRNA表达的抑制效率高,两组应用R3 siRNA后的LIMK2 mRNA表达量分别为对照组的19.30%(转染后24 h)、18.63%(转染后48 h);Western blot检测显示编码为R3的siRNA对LIMK2蛋白表达的抑制效果明显,两组应用R3 siRNA的LIMK2蛋白表达量分别仅为空白对照组的1.32%(转染后24 h)、1.19%(转染后48 h).结论 编号为R3的siRNA可以很好地抑制小鼠原代成骨细胞的LIMK2表达.
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不同自酸蚀黏接系统对窝沟封闭剂微渗漏影响的实验研究
目的 探讨不同自酸蚀黏接系统对窝沟封闭剂封闭性能和渗透性的影响.方法 收集新鲜拔除的离体第三磨牙36颗,随机分成4组,每组9颗, 面釉质以杯刷清洁30 s;以37%正磷酸酸蚀作为对照组,以ClearFil SE Bond、XenoⅢ以及iBond分别对牙釉质进行黏接作为实验组.涂布可见光固化窝沟封闭剂3M Concise White,光照固化.每组中8颗用1%亚甲基蓝进行染色法检查微渗漏,1颗采用扫描电镜观察封闭剂渗入窝沟的深度以及窝沟封闭剂和牙体组织之间的结合界面的状况.结果 ClearFil SE Bond以及XenoⅢ自酸蚀黏接时,对封闭剂微渗漏的影响与对照组相比差异无统计学意义;扫描电镜下,磷酸酸蚀、ClearFil SE Bond以及XenoⅢ组在窝沟封闭中使封闭剂与牙釉质密合性好.结论 第五代自酸蚀黏接剂ClearFil SE Bond以及第六代XenoⅢ与牙釉质之间具有良好的封闭能力,可以推荐临床使用.
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新型LED比色光源下口腔比色板色度值研究
目的研究自制白光发光二极管（LED）矩阵光源光学参数及其对口腔比色版的色度值影响，为研发便携式LED口腔比色光源提供数据参考。方法采用波长主峰为450～470 nm单晶GaN蓝光LED矩阵，在其表面涂覆稀土钇铝石榴石（YAG）荧光粉并使用一定比例硅酸盐红色荧光粉调节色温的方法制作色温接近5500 K的连续光谱白光光源。使用4π结构积分球测试LED光源光学指数并了解其与D55标准照明体的拟合程度。并将此光源与人工日光D65标准光源作对照，观察二者对各3块口腔常用Vita 3D Master和Vita Classia比色板CIE L*、a*、b*色度值的影响，并用ΔE*94值对差别进行比较。结果自制白光LED光源光通量φ＝389.90 lm，色品坐标x＝0.3342、y＝0.3335，色温Tc＝5453 K，主波长λd＝600.2 nm，峰值波长λp＝455.0 nm，半宽度Δλp＝25.6 nm，显色指数Ra＝95.3。3块VITA 3D Master和VITA Classial 上同一色标L*、a*、b*均值在同一光源下两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。不同光源下VITA 3D Master和VITA Classial各色标间色差ΔE*94均值分别为1.58和0.96 NBS。结论自制白光LED矩阵光源达到D55标准照明体的色温和显色指数要求，能作为重组日光光源以替代自然日光应用于口腔临床。
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神经-肿瘤相互作用对腺样囊性癌细胞侵袭、生存能力及基因表达的影响
目的：探讨神经微环境对腺样囊性癌（ACC）细胞侵袭、生存能力及基因表达的影响。方法通过免疫组织化学、ACC嗜神经侵袭体外模型、结合基因芯片技术，对临床病理标本及肿瘤细胞进行研究。结果32例ACC中有25例（78.1％）发生了嗜神经侵袭，其中实性型与筛孔型的嗜神经发生率较管状型高（P=0.03）；神经组织与肿瘤细胞相互作用可以提高肿瘤细胞的生存能力、减少凋亡；通过基因芯片技术，在ACC-M与神经相互作用过程中筛选出369个表达上调的基因和920个表达下调的基因，其中许多基因已经证实参与调节细胞生长、凋亡、运动以及黏附等重要的生物过程。结论本研究初步揭示了神经组织与ACC细胞相互作用为肿瘤细胞提供了生存优势条件，为进一步对ACC嗜神经侵袭机制的研究提供了部分参考。
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白细胞介素-6在大鼠慢性牙周炎合并动脉粥样硬化模型中的表达
目的 探讨大鼠慢性牙周炎(CP)合并动脉粥样硬化(As)模型中牙周组织、As斑块中血清白细胞介素-6(IL-6)的表达.方法 60只成年Wistar雄鼠随机分为4组:正常对照组(A组)、CP组(B组)、As组(C组)、CP加As组(D组),每组15只,各组接受相应的建模处理.观察牙周组织及动脉血管病理改变,免疫组织化学方法半定量分析牙周组织及As斑块中IL-6表达,酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清IL-6水平.结果 牙周病理学观察:B、D组实验牙牙周炎症表现明显,附着丧失(AL)水平较A、C组有明显增加(P ＜ 0.05).动脉病理学观察:C、D组主动脉形成粥样硬化病变.免疫组化染色:B、D组IL-6在牙周组织及血清中的表达均高于其他组(P ＜ 0.05),D组As斑块中IL-6表达高于其他组(P ＜ 0.05).相关性分析显示,D组IL-6在牙周组织与As斑块中的表达呈正相关.结论 CP与As的发生发展可能与IL-6表达升高有关.
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负向调控基质金属蛋白酶-2的表达抑制成釉细胞瘤的侵袭性
目的 探讨基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)靶向小干扰RNA(siRNA)对成釉细胞瘤(AM)细胞MMP-2基因的负向调控作用及对AM侵袭性的抑制作用.方法 培养成釉细胞瘤细胞,应用免疫荧光法检测成釉细胞瘤中MMP-2的表达;体外构建MMP-2靶向siRNA质粒表达载体,并转染成釉细胞瘤细胞,激光共聚焦显微镜检测siRNA质粒表达载体的转染效果,流式细胞仪检测转染效率,逆转录聚合酶链反应检测MMP-2 mRNA的改变,免疫印迹法检测细胞MMP-2蛋白表达,侵袭小室微侵袭分析检测细胞的侵袭性,对统计结果进行方差分析.结果 成釉细胞瘤中MMP-2呈阳性表达,siRNA质粒表达载体对成釉细胞瘤细胞的转染率为63.6%;转染后,成釉细胞瘤细胞的MMP-2 mRNA表达减少69.3%,MMP-2蛋白表达减少64.2%,P ＜ 0.05,细胞的侵袭抑制率为61.2%.结论 MMP-2靶向siRNA表达质粒成功转染成釉细胞瘤细胞并沉默MMP-2基因,MMP-2与细胞的侵袭性密切相关.
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NAF1基因对舌鳞状细胞癌细胞增殖转移能力的影响
目的：使用小干扰RNA(siRNA)干扰舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中营养缺乏自噬因子1(NAF1)的表达,观察对NAF1基因的沉默效果,并测定沉默后Tca8113细胞生长增殖侵袭能力的变化。方法建立小干扰RNA(si-NAF1)组、阴性对照(si-NC)组、对照(vector)组。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western blotting法检测NAF1、细胞周期素D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达。 MTT实验检测细胞增殖能力,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell法观察各组细胞侵袭能力变化。结果与vector组相比,NAF1-siRNA干预Tca8113细胞后,si-NAF1组NAF1的mRNA和蛋白表达水平都明显降低(x2=25.65,t=-17.1,P<0.05),cyclin D1、MMP-2蛋白表达水平降低(tcyclin D1=-14.7,tMMP-2=-9.6,P<0.05),细胞增殖能力明显降低(t=-36.77,P<0.05),克隆形成能力明显减弱(t=-12.33,P<0.05),侵袭能力明显降低,si-NAF1组穿过Transwell膜的细胞少于vector组。结论通过siRNA技术降低NAF1表达可能通过降低cyclin D1水平抑制舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的增殖能力,通过影响MMP-2蛋白表达水平,抑制Tca8113细胞的侵袭能力。
