我国虫媒病毒分子生物学研究进展
摘要： 虫媒病毒(Arbovirus)是指一类通过吸血昆虫叮咬敏感的脊椎动物而在人、畜间传播的病毒.国际上已发现537种,其中130余种可引起人畜疾病,表现为发热、皮疹、关节痛、出血热甚至病毒性脑炎等.在人类历史上虫媒病毒曾经使成千上万的人畜患病或死亡,造成巨大的经济损失.目前虫媒病毒仍然在各国甚至在世界范围造成严重传染病的流行[1].
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江阴市HIV-1感染者亚型及原发耐药基因突变研究
目的 了解江阴市2013-2015年常住人口中新发HIV-1感染者亚型分布及原发耐药基因变异情况.方法 选取江阴市疾病预防控制中心2013-2015年确认和管理的111例常住人口新发HIV-1感染者为研究对象,收集其抗凝全血标本,提取DNA并扩增HIV病毒pol区部分基因,通过系统进化树判断患者亚型;根据WHO耐药突变位点列表及美国斯坦福大学HIV耐药数据库,确定耐药基因突变位点及耐药程度.结果 111例样本中,pol区成功扩增并测序100例,系统进化树结果确定江阴市HIV-1流行毒株分属7种亚型和重组型,以CRF01 _AE (44/100)、CRF07_BC (21/100)以及CRF67_01B(14/100)亚型为主.耐药位点检测结果显示,14例患者体内存在原发耐药基因突变位点,原发耐药率为14.0％ (14/100),核苷类反转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)以及蛋白酶抑制剂(PIs)耐药突变率分别为3.0％、7.0％、6.0％.2～4年随访调查结果显示,14例基因型耐药患者有9例患者在治疗过程中发生了临床耐药,耐药率为8.1％ (9/111),其中5例患者为CRF01_AE亚型.结论 2013-2015年常住人口中新发HIV-1感染者亚型分布呈现多样性,且存在一定比例的原发耐药基因突变;新发HIV感染者在接受抗病毒治疗前进行耐药基因检测,并制定合理的抗病毒治疗方案,可减少耐药株的产生.
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青海省2016-2017年人肠道病毒A组71型基因特征
目的 对青海省2016-2017年手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)人肠道病毒A组71型(human enterovirus group A type 71,EV-A71)的基因特征进行分析.方法 对青海省2016-2017年采集的HFMD标本,用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法进行筛查,对EV-A71阳性标本进行病毒分离,对分离到的病毒提取核酸,用RT-PCR方法对VP1编码区进行扩增及核苷酸序列测定和分析,并与EV-A71各基因型和基因亚型的代表株序列构建亲缘关系进化树.结果 青海省2016-2017年共分离到114株EV-A71,均为C4基因亚型中的C4a进化分支.在亲缘性关系树中显示,又进一步分属2个不同的小分支.2016-2017年青海省流行的不同传播链上EV-A71与我国其他省流行的EV-A71基因亲缘关系较为接近.结论 青海省2016-2017年流行的EV-A71以C4a为绝对优势基因亚型,未监测到其他基因型病毒.青海省EV-A71不是独立进化的,而是与我国其他地区流行的EV-A71共同进化.
关键词： 手足口病 人肠道病毒A组71型 C4a基因亚型 -
肠道病毒5'-非翻译区测序分型的应用评估
目的 评估5’-非翻译区(5’-untranslated region,5’-UTR)扩增测序法对临床标本直接进行肠道病毒(enterovirus,EV)血清型分型的价值.方法 收集实时荧光聚合酶链反应(real-time PCR)检测EV通用型核酸为阳性的肛拭518份、鼻拭148份,采用5’-UTR区逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)对标本中的EV进行扩增、测序、比对及血清型分型,与VP1(viral protein 1)区简并引物巢式PCR测序分型方法比较,两者不一致的标本经EV血清型特异性RT-PCR验证.结果 666份EV通用型核酸为阳性的标本,5’-UTR和VP1区各分型成功553例(83.0％)和318例(47.7％),P＜0.001;以VP1法为参考,对肛拭中主要检出的血清型CoxA6(217例)、CoxA 16(88例)、EVA71(40例)、CoxA10(28例)和CoxA4(27例),5’-UTR法敏感度(57.1％～100％)、特异度(67.4％～98.1％)以及方法一致性(kappa值0.188 ～0.847),均因血清型而异;对鼻拭中主要检出的血清型EVD68(15例),5’-UTR法敏感度100％,特异度91.1％,一致性差(kappa值0.217).分型不一致标本,经CoxA6、CoxA 16、EVA71、CoxA10和EVD68型特异性RT-PCR验证,大部分得以确认.以VP1法联合型特异性RT-PCR法为参考,5’-UTR法的敏感度和特异性以及与参考方法的一致性均提高.结论 5’-UTR对肠道病毒的分型的敏感度和特异度因血清型而异,应用时应根据研究目的综合考虑.
关键词： 肠道病毒 5'-非翻译区 逆转录·聚合酶链式反应 测序 分型 -
流感病毒唾液酸受体在哮喘小鼠气道组织的分布和表达
目的 观察对比流感病毒唾液酸a2,3-半乳糖(SAa2,3-gal)和唾液酸a2,6-半乳糖(SAa2,6-gal)受体在哮喘小鼠气道组织中的分布和表达以及地塞米松干预对其表达的影响.方法 30只BALB/c小鼠被随机分成正常组(N组)、哮喘组(A组)和地塞米松干预组(D组).A组小鼠以卵蛋白(OVA)致敏后激发建立哮喘模型,D组激发前腹腔注射地塞米松,余同A组.行BALF细胞计数,ELISA测定BALF中IL-5浓度,HE染色观察肺组织病理学改变及气道炎症评分,AB-PAS染色观察黏液分泌,免疫组化法(IHC)观察肺组织Muc5ac蛋白表达,免疫荧光法观察各组小鼠气道组织中唾液酸受体分布和表达的差异.结果 A组小鼠BALF嗜酸性粒细胞数、IL-5浓度、气道炎症评分、气道黏液分泌较N组小鼠均升高,而D组小鼠上述指标较A组降低.SAa2,3-gal和SAa2,6-gal受体在各组气道组织中均有表达.SAa2,3-gal受体在哮喘组气道上皮细胞表达的平均阳性率较N组升高,SAa2,3-gal和SAa2,6-gal受体在D组气道上皮细胞分布和表达的平均阳性率均较N组和A组升高(P＜0.05).结论哮喘组小鼠气道上皮SAa2,3-gal受体的表达增强;地塞米松上调SAa2,3-gal和SAa2,6-gal受体的表达.两者可能是哮喘患者对流感病毒易感性增强的原因之一.
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HBVpreC/C区基因突变与原发性肝癌预后的关系
目的 研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)preC/C区基因突变与原发性肝癌患者预后的关系.方法 收集81例乙型肝炎病毒相关性肝细胞肝癌(hepatitis B virus associated hepatocellular carcinoma,HBV-HCC)患者的癌组织并提取基因组DNA,对HBV preC/C区基因进行扩增和测序,并根据NCBI数据库鉴定出其突变位点,运用Kaplan-Meier和Cox回归等方法分析HBV-HCC患者的临床资料、突变位点与其术后生存期之间的关系.结果 门脉瘤栓、肿瘤分期和肿瘤大小是与HBV-HCC患者术后生存相关的独立危险因素.1915、2134、2176、2221和2260突变位点被确定为预测HBV-HCC患者生存相关的独立危险因子,1979和2245突变位点与HBV-HCC患者生存具有临界统计学差异.结论 门脉瘤栓、肿瘤分期和肿瘤大小以及HBV preC/C区基因的以上7个突变位点被确定为与肝癌患者术后预后相关的独立危险因素.
关键词： HBV-HCC HBVpreC/C区 HBV-DNA 突变位点 预后 -
单向免疫扩散测定四价流感病毒裂解疫苗中两种B型血凝素含量
目的 四价流感病毒裂解疫苗在三价疫苗中新增一个谱系的B型血凝素抗原,单向免疫扩散法(single radial immunodiffusion,SRID)是否能准确测定四价疫苗中两种谱系的B型血凝素抗原含量.方法 采用江苏金迪克生物技术有限公司研制的四价流感病毒裂解疫苗,运用SRID进行测定.结果 在正常检测范围内(10～40μg/ml)比较标准品抗原对照、单价样品、B1+B2单价样品的血凝素测定值差异无统计学意义(P>0.05).在10～160μg/ml检测范围内分别以三价苗和固定浓度30μg/ml的B型血凝素为基质稀释待测的另一B型血凝素,与该B型不同稀释度的单一血凝素测定结果进行比较,以测定两种B型流感血凝素有无互相干扰.在流感疫苗血凝素检测范围10～40μg/ml之内时,检测的血凝素含量与沉淀环直径呈正比关系(决定系数R2=0.998),而在10～160μg/ml检测范围内,三元线性回归方程拟合度高(决定系数R2=0.999).结论 单向免疫扩散法检测B1和B2毒株的血凝素抗原在10～40μg/ml和10～160μg/ml范围内和存在其他三种血凝素或另一B型血凝素时,均未见互相干扰.
关键词： 四价流感病毒裂解疫苗 B型血凝素含量 单向免疫扩散法 抗原 线性回归 -
丙型肝炎病毒和丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型的关系研究
目的 探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)对丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型(SPINK1)表达的影响及其临床意义.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot印迹法检测JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1细胞及其对照细胞中SPINK1 mRNA和蛋白的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清及丙肝患者血清中SPINK1的含量,分析健康对照者及丙肝患者SPINK1血清含量的差异.结果 HCV感染的Huh7.5.1细胞中SPINK1 mRNA和蛋白的表达水平较对照细胞高;SPINK1血清含量在丙肝患者明显高于健康体检者(P=0.016).结论 HCV能够上调SPINK1的表达.
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乙型肝炎病毒X蛋白对B7-H6基因的激活作用
目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对人B7-H6基因的激活作用.方法 提取人基因组DNA作为模版,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获取约2.2 Kb B7-H6基因启动子DNA片段,扩增产物经Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入到pGL3-Basic中构建双荧光素酶报告基因pGL3-B7-H6,测序正确后分别与HBV病毒蛋白S、C和X的真核表达质粒pCMV-HBs、pCMV-HBc和pCMV-HBx共转染HepG2细胞,检测荧光素酶活性变化,然后用不同剂量的pCMV-HBx表达质粒与pGL3-B7-H6共转染HepG2细胞,Western blot检测B7-H6蛋白表达水平.结果 本研究克隆出的B7-H6基因启动子片段序列与GenBank中记录一致,pGL3-B7-H6构建成功.pGL3-B7-H6启动子质粒转染HepG2细胞荧光素酶活性较转染空载体pGL3-Basic组显著增加(5.24 ±1.25 vs.1.12 ±0.31,P=0.005).pGL3-B7-H6启动子质粒与pCMV-HBx质粒共转染HepG2细胞,荧光素酶活性较对照组显著增加(17.60±3.36 vs.6.73±1.36,P=0.001).Western blot结果显示,HBx蛋白可显著增强B7-H6蛋白的表达.结论 本研究发现HBx蛋白可能增强B7-H6基因启动子的转录活性并促进B7-H6蛋白的表达.
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慢性HBV感染者调节性T细胞水平及Foxp3与CD127表达关系的研究
目的 探讨慢性HBV感染者外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞(RegulatoryT,Treg)的水平,并研究其两种细胞标志--CD127分子的低表达与Foxp3转录因子表达之间的关系.方法 采集34例免疫耐受期、26例免疫清除期和31例非活动或低(非)复制期慢性HBV感染者的外周全血,用流式细胞术分析CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞和CD4~+CD25~+CD127~(low)T细胞的频率.结果 在慢性HBV感染者外周血中,免疫耐受组CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞和CD4~+CD25~+CD127~(low)T细胞的频率均比非活动或低(非)复制组高(Z=-2.693,P=0.007和t=3.251,P=0.002);且病毒阳性组(免疫耐受组+免疫清除组)比非活动或低(非)复制组高(t=2.266,P=0.026和t=3.208,P=0.002);ALT异常组(免疫清除组)与ALT正常组(免疫耐受组+非活动或低(非)复制组)之间的比较差异无统计学意义(P>0.05).91例病例外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞和CD4~+CD25~+CD127~(low)T细胞之间的表达有一致性,但两者频率的差异有统计学意义(Z=-4.718,P<0.001).结论 调节性T细胞在慢性HBV感染者病毒高复制组中明显升高.CD4~+CD25~+T细胞中CD127分子的低表达与Foxp3转录因子的表达有一致性,但前者代表Treg的频率明显高于后者.
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山西省乙型肝炎病毒基因型别的初步研究
目的 初步确定流行于山西地区的乙肝病毒的基因型的基本情况.方法 采集山西地区乙型肝炎表面抗原阳性的血清,利用PCR扩增得到HBV的S基因和C基因;用MEGA3软件对其进行核苷酸序列分析,构建系统发生树,分析基因型.结果 约93%样本的HBV S基因和C基因序列均位于HBV系统发生树的基因型C,近7%的样本其S基因和C基因序列位于系统发生树的基因型B.结论 流行于山西地区的乙肝病毒多数为基因型C,少数为基因型B,未发现基因重组现象.
