重组AAV2/hFⅨ病毒制备及其基因治疗血友病B的实验研究

目的制备携带人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因的重组AAV2病毒(rAAV2/hFⅨ),并对用rAAV2/hFⅨ肌肉注射治疗血友病B模型小鼠的疗效进行评价.方法通过"一株载体细胞/一株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV2/hFⅨ,体外转导BHK-21、C2C12细胞后,检测细胞培养上清中hFⅨ的表达量;肌肉直接注射血友病B模型小鼠后,检测其血浆中hFⅨ的抗原水平和凝血活性等指标.结果转导24 h后在细胞上清中即可检测到hFⅨ,连续检测120 h都有表达,BHK-21、C2C1 2细胞24 h高表达量分别达到(51.0±6.5)ng/105细胞和(68.0±7.2)ng/105细胞.rAAV2/hFⅨ经肌肉直接注射后,高、中、低三个剂量组均能检测到小鼠体内高效表达hFⅨ,在给药后第3周达到高峰,小鼠血浆中hFⅨ的表达量与对照组比较差异有显著性(P＜0.01),之后缓慢下降,到第10周仍可检测到低水平hFⅨ表达;取第3周小鼠血浆样品检测凝血功能,高、中、低剂量组FⅨ活性均得到明显改善,小鼠的割尾实验出血时间明显缩短,5 min失血量也相应显著减少,其中高剂量组hFⅨ高表达量达到(387.0±12.5)ng/ml血浆,FⅨ活性达到正常水平的(30.0±5.5)%;给药后第10周,除在注射点外,其它主要脏器均未检测到AAV载体DNA.结论制备的rAAV2/hFⅨ病毒在体外培养细胞中能高水平表达hFⅨ,肌肉注射能有效治疗血友病B模型小鼠,为临床应用该基因治疗血友病B提供了科学依据.

血管内皮生长因子对CD34+干/祖细胞来源的树突细胞分化及功能的影响

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)对人脐血CD34+干/祖细胞来源的树突细胞(dendritic cell,DC)分化和功能的影响.方法利用免疫磁珠分离法(MACS)分离纯化脐血CD34+造血干/祖细胞,并在体外将其诱导扩增为DC,观察VEGF在培养早期和晚期对DC分化和功能的影响.观察培养过程中细胞增殖方式,用流式细胞术检测DC表面分化相关抗原CD1α、CD83、CD80、CD54、HLA-DR等的表达,混合淋巴细胞反应法测定DC体外刺激同种异体T细胞增殖的能力,ELISA法检测DC培养上清中IL-12的含量.结果在细胞增殖方面,培养第1天加入VEGF(25 ng/ml)可显著促进细胞增殖,第14天收获的总细胞数量较对照组增高(1.51±0.23)倍(P=0.001),而培养第9天加入VEGF则未出现明显的促细胞增殖效应(P＞0.05);在细胞分化和功能方面,培养第1天加入VEGF明显抑制DC的分化和功能,第1天加VEGF组和对照组DC分化抗原的表达CD1a分别为(33.00±2.12)%和(81.20±6.93)%,CD83分别为(42.23±1.15)%和(87.98±9.79)%,CD80分别为(42.93±1.32)%和(94.53±0.87)%,HLA-DR分别为(37.93±5.30)%和(74.1 5±3.74)%(P值均＜0.001),同时CD14的表达较对照组明显升高;刺激同种异体T淋巴细胞增殖和IL-12分泌的能力明显降低,与对照组相比均有显著性差异(P值均＜0.01),而第9天加入VEGF则对于DC表面分化抗原的表达和功能没有显著的影响.结论VEGF在早期可促进造血干/祖细胞的增殖,同时抑制其向DC分化成熟和功能,但在晚期则对增殖和分化无明显影响.

bcr-abl基因阳性血小板增多症八例报告--附文献复习

目的分析8例bcr-abl融合基因阳性(Bcr+)血小板增多症特点并对其归属提出探讨意见.方法回顾性分析8例Bcr+血小板增多症患者的临床、血液学、治疗转归,并与经典原发性血小板增多症(ET)和血小板增多的慢性粒细胞白血病慢性期(CML-CP-T)比较其异同,以PCR法检查bcr-abl融合基因.结果除bcr-abl融合基因外,Bcr+血小板增多症在临床、血液学、治疗转归与ET无明显差异;与CML-CP-T不同在于:女性较多,脾脏多不肿大或轻度肿大,外周血白细胞增高,但＜40×109/L,嗜碱粒细胞不增高,幼稚粒细胞少见,骨髓有核细胞以粒、巨核两系或单巨核系增生,中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)积分正常或增高,少有急性转化.结论Bcr+血小板增多症作为慢性骨髓增殖性疾病新的一员变异型ET,尚需进一步研究.

组织因子/活化因子Ⅶ复合物影响人卵巢癌细胞侵袭及转移能力的研究

目的研究组织因子/活化因子Ⅶ(TF/FⅦa)复合物对人卵巢癌细胞体外侵袭能力及体内转移能力的影响.方法①采用分子克隆及基因转染技术构建高效表达TF的人卵巢癌细胞系A2780/TF;②采用Boyden小室法计数FⅦa刺激后A2780、A2780/TF穿透Matrigel迁移到PVPF膜背面的细胞数;③建立人卵巢癌细胞转移的实验动物模型,研究TF对人卵巢癌细胞在裸鼠体内形成转移灶的能力.结果①经分子克隆技术构建得到pcDNA3-TF cDNA重组体;②稳定转染的A2780/TF细胞内TF mRNA水平显著增高:转染细胞为3.99±0.15,未转染细胞为0.97±0.23(P＜0.01);转染细胞表面TF表达也显著增高:转染细胞中约(48.56±9.53)%细胞表面有TF抗原,而未转染细胞中仅(2.73±1.15)%(P＜0.01);③A2780/TF细胞穿膜细胞数为157.3±19.2,经FⅦa刺激后穿膜细胞数显著增多,为447.7土39.4(P＜0.01);与FⅦa和抗TF单抗共孵育的A2780/TF,穿膜细胞数接近刺激前的基础水平;④种植A2780细胞的裸鼠中22.2%可见肺部转移灶,种植A2780/TF细胞的裸鼠中88.9%发生肺转移(P＜0.01).结论①将所构建的TF真核表达载体转入人卵巢癌细胞系,获得稳定、高效表达TF的人卵巢癌细胞系A2780/TF,为研究TF在肿瘤侵袭、转移中的作用及其机制,探索抑癌基因治疗新途径建立了初步的实验基础;②TF可通过与FⅦa形成复合物而增强人卵巢癌细胞的体外侵袭能力及体内转移能力.

一例May-Hegglin异常家系临床及分子生物学研究

目的探讨May-Hegglin异常(MHA)患者的血小板改变及其分子遗传学特征.方法对先证者及其家系成员的静脉血,分别进行机数和镜数血小板计数,观察血小板形态,以流式细胞术分析血小板膜蛋白,ELISA法检测血小板膜抗体,用聚合酶链反应(PCR)技术扩增先证者及其父亲非肌性肌球蛋白重链9基因(MYH-9)的25,30,38,40号外显子,分析PCR产物的核苷酸序列,确定突变点,用间接免疫荧光结合细胞核染色技术显示粒细胞中的包涵体(D6hle小体).结果患者机数血小板数明显低于镜数血小板数,巨大血小板占90%以上,血小板膜糖蛋白(CD41、CD61、CD42a、CD42b)均在正常范围内,膜抗体未能检测到,血小板功能正常,MYH-9基因38号外显子第5521位核苷酸存在G→A杂合突变(GAG→AAG),从而导致其编码的非肌性肌球蛋白重链A(NMMHC-A)第1841位谷氨酸变为赖氨酸,正常对照及家系中正常者未见此突变,MHA患者中性粒细胞胞浆中荧光分布显示了"梭形"包涵体的形态和轮廓.结论MYH-9基因点突变并伴有血小板减少和巨大血小板是MHA的主要特征.

三七皂甙单体2A-1-1对人血小板聚集和钙内流的作用

目的观察三七皂甙单体2A-1-1对人血小板聚集和钙内流的影响,并探讨其对受体操纵性钙通道的作用.方法比浊法测定血小板聚集;Fura-2/Am荧光探针双波长测定细胞胞浆游离钙浓度,观察2A-1-1、硝苯地平、SK＆F96365对二磷酸腺苷(ADP)、环匹阿尼酸(CPA)介导的人血小板钙内流的变化.结果硝苯地平(20μmol/L)不能抑制ADP诱导的血小板聚集,不能抑制ADP或CPA介导的血小板钙内流;SK＆F96365(20μmol/L)可以抑制ADP诱导的血小板聚集,抑制率为59.83%;SK＆F96365(15μmol/L)可以抑制CPA和ADP介导的钙内流;2A-1-1(5,10,20,μmol/L)可抑制ADP诱导的血小板聚集,抑制率分别为47.06%,53.47%,71.52%;2A-1-1(10,20 μmol/L)可抑制CPA和ADP介导的钙内流.结论三七皂甙单体2A-1-1能抑制人血小板聚集,抑制血小板受体操纵性钙通道,从而抑制钙内流,有抗血小板作用.

凝血因子X基因两种新的突变导致的遗传性凝血因子X缺陷症

目的探讨1个遗传性凝血因子X(FX)缺陷症家系的分子发病机制.方法测定活化部分凝血活酶时间,凝血酶原时间、FX促凝活性以及FX抗原进行表型诊断;用PCR方法对先证者的FX基因8个外显子及其侧翼序列和5′端非翻译区(5′UTR)序列进行扩增,产物纯化后直接测序检测其基因突变.应用等位基因特异性PCR验证测序所发现的突变.结果先证者表型诊断为FX缺陷症(Ⅱ型);FX基因分析发现2个杂合突变:第1内含子5′端剪接位点供位GT→AT(IVS1+1G→A)和第8外显子1185G→A(Arg347His).结论双重杂合性突变IVS1+1G→A和Arg347His是导致该例遗传性FX缺陷症的原因.

ALK-1基因无义突变Arg 479 Stop导致的遗传性出血性毛细血管扩张症

目的对一个遗传性出血性毛细血管扩张症家系进行Endoglin基因和ALK-1基因突变检测,以探讨其病因.方法用PCR法对先证者的Endogiin基因14个外显子和ALK-1基因10个外显子及其侧翼序列和5′端非翻译区(5′UTR)序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变.针对家系成员3代23人基因突变区域进行扩增后测序.结果发现先证者及家系其他患者ALK-1基因第10外显子1437C→T,导致479位氨基酸Arg(CGA)变为Stop(UGA),均为杂合突变.结论杂合无义突变C1437T引起的Arg479 Stop是导致本家系遗传性出血性毛细血管扩张症的原因.

T细胞大颗粒淋巴细胞白血病合并纯红细胞再生障碍一例

患者,男,33岁.因进行性面色苍白、乏力1个月于2003年10月1 6日来我院就诊.患者近1个月出现面色苍白、乏力,进行性加重,无发热,无黄染,无血尿、黑便,无茶色尿,于外院发现"贫血"(具体数值不详),给予叶酸,Vit B12治疗2周,症状无改善,为求进一步诊治来院.查体:重度贫血貌,全身皮肤、黏膜无瘀点、瘀斑,浅表淋巴结未触及,睑结膜苍白,巩膜无黄染,牙龈苍白,咽无充血,舌面光滑,舌乳头无萎缩;胸骨无压痛,双肺呼吸音清,心律齐,心率90次/min;腹软,肝脾肋缘下未触及.血常规:Hb 40 g/L,RBC 1.05×1012/L,MCV 122.9 fl,MCH 38.1 pg,MCHC 310 g/L,Ret0.0025,WBC 9.85×109/L,分类:中性杆状核细胞0.01,中性分叶核细胞0.07,淋巴细胞0.90(其中大颗粒淋巴细胞为0.74),单核细胞0.02,BPC 251×109/L.骨髓象:增生明显活跃,粒系0.750,红系0.045,淋巴细胞0.215(其中大颗粒淋巴细胞为0.170),巨核细胞334个/片.Coombs试验(-),血浆游离血红蛋白33.8 mg/L,血浆结合珠蛋白1.5g/L.叶酸＞45 nmol/L,VitB12 288 pmol/L.抗核抗体(-),免疫复合物(-),抗"O"99.5 U,类风湿因子20×103IU/L,C反应蛋白0.06 mg/L.

以血小板减少为首发症状的骨髓增生异常综合征一例

患者,女,54岁,因双下肢瘀点于2002年3月在我院就诊.既往体健,发病前无感染史、服药史和毒物接触史,家族中无类似患者;体检无肝、脾肿大.血常规:WBC 5.5×109/L,Hb 112 g/L,BPC 61×109/L,中性粒细胞0.64,淋巴细胞0.35,单核细胞0.01.骨髓检查示增生明显活跃,粒、红比为2.46:1,粒系0.58,红系0.23,淋巴细胞0.16,巨核细胞＞200个/片,颗粒型巨核细胞比例明显增高,并可见典型小巨核细胞,红系偶见类巨幼变,粒系未见形态异常;肝、肾功能正常,PAIgG阴性.予泼尼松1 mg/kg治疗3个月,血小板回升至90×109/L时开始减量,但减量后血小板即下降,双下肢瘀点再次出现,复查血常规示WBC 3.3×109/L,Hb115 g/L,BPC 46×109/L,加用维甲酸、硫唑嘌呤和氨肽素,血小板再次上升,现维持在80×109/L左右,WBC维持在(3.5～3.8)×109/L.2002年6月染色体检查为正常核型,2003年1月和4月复查染色体发现有8三体克隆.对第1次的染色体标本进行荧光原位杂交(FISH)检测,证实患者确实存在着8三体异常克隆(10.5%).

血友病B合并急性淋巴细胞白血病一例

患者,男,50岁,因反复皮肤瘀斑、关节肿胀36年,乏力、发热、血尿半个月于2003年11月1日入院.患者于1967年4月7日因"右下肢肿胀、不能活动10余天"在外院就诊,查体:右小腿肿胀、青紫,右膝、右踝关节不能活动,穿刺液为血液,出血时间及血小板计数正常,试管法凝血时间40 min,拟诊为"血友病",输新鲜全血后病情好转.以后反复出现皮肤瘀斑,膝、踝、肘关节肿胀疼痛,每年平均输血2次.半月前明显头昏、乏力、发热,体温高38.2℃,尿色发红,当地医院查血常规:Hb 52 g/L,WBC 5.9×109/L,BPC不详,输血对症处理后症状无明显改善,为进一步诊治入我院.其舅与表兄均在儿童期死于"出血",表弟43岁,膝关节畸形,外甥¨岁时死于"脑出血".查体:体温37.8℃,精神差,贫血貌,上肢静脉穿刺及臀部肌肉注射处见大片瘀斑,左锁骨上窝扪及数个黄豆大小淋巴结,口腔黏膜见数个小血泡,牙龈少量渗血,胸骨无压痛,肝、脾肋下未扪及,双膝、双踝、双肘关节肿胀畸形,活动受限,右侧明显,双下肢肌肉明显萎缩.实验室检查血常规:Hb 61g/L,WBC 4.98×109/L,BPC 9×109/L,中性中幼粒细胞0.01,分叶核粒细胞0.01,原始+幼稚淋巴细胞0.82,成熟淋巴细胞0.16.

P21、P27在造血干/祖细胞增殖调控中的作用

P21、P27是细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CKIs)Cip/Kip两大家族的重要成员,主要通过抑制Cyclin E-CDK2和Cyclin D-CDK4/CDK6的活性而发挥对细胞周期的负向调节作用.近研究表明,P21、P27可分别调控造血干/祖细胞的增殖水平,呈现特异的分化阶段依赖性.这为体内外造血干/祖细胞的扩增提供了可操纵的靶分子,对治疗性干细胞的应用及基因修饰具有重要意义.我们就这方面的进展作一综述.

慢性特发性血小板减少性紫癜患者血清瘦素水平测定

近年来的研究表明,内分泌系统无论是对体液免疫还是细胞免疫都发挥着重要作用.很多自身免疫性疾病不仅与性别密切相关,与其内分泌激素的水平及调节也明显相关[1].瘦素(leptin)是由脂肪细胞产生的一种激素样细胞因子[2],是由167个氨基酸组成的蛋白质.初研究认为其与食物摄取和脂肪代谢有关,近的研究发现瘦素可以活化CD4+T辅助细胞[3].瘦素水平下降导致免疫抑制,慢性瘦素缺乏者Th1型细胞功能下降而Th2型细胞功能上升.一系列研究表明瘦素可以诱发甚至加重实验性自身免疫性多发性硬化病动物的病情.其他结缔组织疾病,诸如系统性红斑狼疮、自身免疫性糖尿病、白塞氏病等也都存在瘦素高水平表达现象[3-5].然而,瘦素对慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)影响的研究还没有被涉及,我们对此进行了研究,以期发现二者之间的联系.

短暂预缺血对血小板活化的影响

缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)是造成组织严重损伤甚至坏死的重要原因,其中血栓形成是影响整个病理过程的重要环节.缺血预适应(Ischemic Preconditioning,IP)的研究显示[1]:短暂预缺血通过多种保护机制削弱了I/R的损伤效应并改善预后,其中的机制之一是减轻I/R中血小板介导的血栓形成.由于只有活化的血小板才能介导血栓形成,因此短暂预缺血对I/R中血小板活化是否有直接影响值得研究.

HIV-1慢病毒载体的构建及结构改造

目前很多基因治疗实验中选择造血干细胞(HSC)等非分裂期细胞作为靶细胞.常用病毒性载体为逆转录病毒和腺病毒载体系统[1,2].逆转录病毒只能转导分裂期细胞,腺病毒载体在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应.来源于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体由于可以感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等特点越来越受到人们的重视[3,4].我们成功构建了慢病毒载体的三质粒包装系统并重点对其中的转移质粒进行了改造,筛选出转导效率较高的慢病毒载体.

特发性血小板减少性紫癜患儿血小板数与T细胞凋亡率的相关性分析

特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopaenic purpura,ITP)是一种自身免疫性疾病,发病机制包括T、B细胞的异常活化和T细胞依赖性自身抗体的产生.以往的研究表明,ITP患者血小板的损伤主要与患者体内抗血小板相关抗体对血小板的损伤作用有关[1].近年来人们发现,ITP患者外周血激活的淋巴细胞增多、细胞凋亡不足与疾病的发生有关[2,3].我们采用流式细胞仪检测ITP患儿外周血T细胞凋亡率,全自动血细胞计数仪检测其血小板数,分析两者间的相关性,探讨T细胞凋亡异常在ITP血小板损伤中的作用.

急性白血病患者白血病细胞TRF1和Tankyrase 1 mRNA表达的研究

一些端粒结合蛋白在调节端粒长度和功能方面起着重要作用.TRF1是端粒长度的负调节因子,与肿瘤的发生、发展有密切关系.为此,我们建立了定量实时RT-PCR法,对急性白血病患者的白血病细胞TRF1、Tankyrase 1(TRF1-interacting ankyrin-related ADP-ribose polymerase 1)及cmyc基因mRNA表达进行了研究.

动脉血栓性疾病凝血因子Ⅴ基因的研究

1993年,Dahlback等[1]发现静脉血栓患者抗活化蛋白C(activated protein C resistance,APCR)现象.在欧洲,已证实凝血因子Ⅴ基因Leiden(FⅤL)G1691 A突变是遗传性静脉血栓的主要机制之一[2,3].我们研究了我国汉族人脑血栓(CT)和急性心肌梗死组(AMI)患者APCR和凝血因子Ⅴ(FV)基因突变.现将结果报道如下.

血管内皮细胞功能检测在慢性肾脏疾病中的临床意义

血管内皮细胞是止血系统的重要组成部分,对止血功能具有双向调节作用.在生理情况下,内皮细胞主要表现为抗血栓作用,但在内皮细胞损伤时则可能促进血栓的发生,加剧了多种疾病的病理过程[1].慢性肾脏疾病中局部内皮细胞损坏所致的凝血和纤维蛋白沉积促进了间质纤维化进程,终引起功能障碍.我们测定了患者血浆和尿液中血管性血友病因子抗原(vWF:Ag)、6-酮-PGF1α、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)的浓度,探讨其如何反映肾脏内皮功能的改变及其临床意义.

K562细胞定向分化时Bcl-6的表达

Bcl-6(B cell lymphoma 6)是原癌基因bcl-6的表达产物,决定着正常淋巴细胞的发育及淋巴组织生发中心形成[1].近研究表明,Bcl-6还在其它许多正常及肿瘤细胞的增殖、分化过程中发挥着十分重要的生物学功能[2,3].人红白血病细胞株K562具有在不同诱导剂作用下分别向红细胞系、巨核细胞系及巨噬细胞系定向分化的特征[4],是研究白血病细胞分化及其机制的理想细胞系,了解Bcl-6在K562细胞定向分化过程中的表达及功能,对进一步了解白血病的发病机制,揭示Bcl-6新的生物学功能有重要意义.

心、脑血管疾病患者血小板膜糖蛋白Ⅰ bα受体表达及其基因可变数目串联重复序列多态性研究

血小板是构成动脉血栓的重要成分之一,血小板的黏附、聚集功能是通过血小板膜糖蛋白(GP)来完成的.1996年Weiss等[1]首先报道了血小板膜GPⅢa pLA2基因多态性与心肌梗死相关,随后对GP Ⅰ b的基因多态性与血栓性疾病的关系展开了广泛的研究.GP Ⅰ bα基因具有高度多态性,第一个被确定的多态性为编码巨球肽区域的39个碱基的可变数目串联重复序列(VNTR),但是VNTR多态性是否为动脉血栓形成的危险因子目前尚未确定,国内在这方面的研究报道甚少.我们的研究目的旨在探讨心、脑血管疾病发病与血小板膜GP Ⅰ bα受体表达及VNTR亚型关系.

肝移植围手术期出血及其治疗

肝脏移植是终末期肝病患者惟一有效的治疗方法,是患者存活的惟一希望.近年来,随着外科学、麻醉学、免疫学及血液学等学科的发展,肝移植的成功率有了很大的提高.国外文献报道,1年及3年的存活率分别为90%和86%,长超过26年.但是,肝移植围手术期的出血是一个棘手问题.术前做好充分的准备,在术中和术后有完善的实验室监测及合理的治疗,这是手术成功的重要环节.

第一届全国肿瘤学进展学术峰会

多功能血细胞分类计数仪以旧换新