siRNA诱导K562细胞凋亡的实验研究

目的构建抗bcr/abl mRNA的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)表达载体,转染K562细胞,检测诱导细胞凋亡的变化.方法参照siRNA模板设计原则,设计并合成两条siRNA模板序列,将其插入质粒pSilencer1.0-U6中得到重组子pBCR6,通过限制性酶切和测序鉴定,大量制备、纯化;以X-tremeGENE Q2介导瞬时转染K562细胞,设置空载体作为对照.在转染后不同时间,利用原位缺口末端标记法(TUNEL)、膜联蛋白Ⅴ+碘化丙锭染色法(AnnexinⅤ/PI)通过流式细胞仪检测K562细胞凋亡的变化. 结果针对bcr/abl mRNA融合区域设计的siRNA模板序列,经筛选合成寡核苷酸链后退火形成双链,再插入pSilencer1.0-U6,经酶切和测序鉴定提示构建成功;大量制备、纯化后进行转染,在转染后48,72 h TUNEL法检测和AnnexinⅤ/PI染色法均显示抗bcr/abl mRNA的siRNA表达载体可有效诱导K562细胞凋亡,且随转染时间的延长凋亡率增高[转染pBCR6 72 h的K562细胞凋亡率为(47.80±1.63)%],与对照组[(6.67±0.37)%]比较差异有显著性(P<0.0001).结论抗bcr/abl mRNA的siRNA表达载体构建成功,初步结果显示它可以有效地诱导K562细胞发生凋亡,预期siRNA有望成为慢性髓系白血病分子靶向治疗的一个新工具.

NK细胞对小鼠异基因骨髓移植造血及免疫重建的影响

目的研究自然杀伤(NK)细胞在小鼠异基因骨髓移植(allo-BMT)中对造血及免疫重建的影响.方法以近交系小鼠C57BL/6(H-2b)为供鼠、BALB/c(H-2d)为受鼠,在allo-BMT同时输入供鼠外周T细胞和(或)NK细胞,计数受鼠移植后不同时间的白细胞数;用流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞和外周淋巴细胞中CD3+和CD19+细胞及表达供鼠基因的H-2Kb+细胞百分率,比较不同移植组存活率、植入水平、造血及免疫重建等.结果输入供鼠外周NK细胞移植组与不输入NK细胞组比较,存活率显著增高(60 d存活率为70% vs 0%);白细胞计数、CD19+细胞及骨髓CD34+细胞计数恢复快;H-2Kb+细胞表达水平高(86.68±4.45 vs 4.68±0.32).移植后第28天(+28天)输入NK细胞组CD3+细胞水平[(33.69±3.36)%]低于未输入NK细胞组[(50.40±5.06)%](P<0.01),在+60天两组比较差异无显著性(P>0.05). 结论在小鼠allo-BMT中,同种异基因反应性NK细胞可以提高造血干细胞的植入水平、促进造血及免疫重建、增高移植受鼠的生存率.

诱骗寡核苷酸靶向阻断信号转导和转录活化蛋白5抑制K562细胞生长增殖

目的观察信号转导和转录活化蛋白5(STAT5)诱骗寡核苷酸(Decoy ODN)靶向阻断STAT5的信号传递对白血病细胞株K562生长增殖的影响,并初步探讨其分子机制.方法将体外设计合成的STAT5 Decoy ODN经阳离子脂质体介导转染K562细胞,通过细胞生长曲线及集落形成实验观察K562细胞生长增殖能力,并用RT-PCR方法检测STAT5下游靶基因的表达. 结果激光共聚焦显微镜观察显示,STAT5 Decoy ODN能高效转染K562细胞,阳性率95.2%;细胞生长曲线显示STAT5 Decoy ODN可显著抑制K562细胞生长,抑制率77.7%;集落形成实验显示STAT5 Decoy ODN能显著抑制K562细胞集落形成能力(Decoy ODN处理组集落形成率为8.3%,空白对照组为35.7%,P <0.05); RT-PCR检测发现STAT5 Decoy ODN处理后K562细胞c-myc、bcl-XL、Cyclin D1基因较对照组分别下调15.4%,30.8%, 29.1%.结论 Decoy ODN可能通过阻止STAT5对靶基因的转录激活,使靶基因表达下调,进而抑制K562细胞生长增殖.

可溶性抗CD47单抗对人树突细胞分化与功能的影响

目的探讨抗CD47可溶性单抗B6H12对树突细胞分化及功能的影响.方法利用rhGM-CSF、IL-4、细菌脂多糖(LPS)组合在体外诱导人外周血单核细胞为树突细胞,并在培养体系中添加单抗B6H12.以透射电镜观察树突细胞形态,流式细胞术分析树突细胞膜表面分子表达.半定量RT-PCR法及ELISA法分别检测树突细胞 IL-12 mRNA表达水平及蛋白质含量.Brdu-ELISA法检测树突细胞刺激同种异型淋巴细胞增殖能力.结果树突细胞膜表面有CD47高表达(94%～98%).B6H12单抗处理的树突细胞组与未加B6H12单抗组比较,CD80+细胞为(68.14±7.41)%vs(89.17±8.59)%;CD86+细胞为(67.33±4.71)% vs(87.27±3.56)%;CD83+细胞为(40.08±14.80)% vs(72.77±8.68)%;CD1a+细胞为(66.45±4.06)% vs(95.93±3.03)%,HLA-DR+ 细胞为(40.67±13.48)% vs(98.97±1.01)%.B6H12单抗显著地下调树突细胞 IL-12 mRNA及IL-12P70表达水平(P＜0.05),且Brdu掺入量也显著的降低(P＜0.01).结论可溶性CD47单抗能影响人树突细胞向成熟分化,并抑制其功能.

吲哚美辛抑制髓系白血病细胞增殖机制的研究

目的探讨吲哚美辛(IN)抗慢性髓系白血病(CML)细胞增殖的作用机制. 方法用MTT法分析IN对慢性髓系白血病细胞系K562及CML患者骨髓细胞活力的影响;Western blot分析CML细胞信号转导和转录活化蛋白(STAT)1、STAT5表达;免疫共沉淀/Western blot分析IN干预后CML细胞磷酸化的STAT1(p-STAT1)和STAT5(p-STAT5)表达,间接免疫荧光技术观察p-STAT1和p-STAT5在CML细胞中的分布及变化;Western blot检测IN干预前后Bcl-XL及环氧化酶-2(COX-2)蛋白的表达. 结果 IN可显著抑制CML细胞活力;400 μmol/L IN作用72 h, CML细胞抑制率为86%;0～400 μmol/L IN呈剂量反应性抑制p-STAT1、p-STAT5表达;p-STAT主要呈散点状分布于胞核中;Bcl-XL蛋白呈IN浓度依赖性表达下调;K562细胞存在COX-2蛋白表达,IN可抑制COX-2蛋白表达. 结论 IN可明显抑制CML细胞增殖;其机制可能与药物抑制STAT/Bcl-XL信号转导途径有关;K562细胞存在COX-2蛋白表达,IN的抗白血病细胞增殖效应可能是通过COX-2依赖性途径实现的.

锤头状核酶抑制CTLL-2细胞凋亡而增强其对Yac-1细胞杀伤活性的实验研究

目的研究抗fas的锤头状核酶对小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)系CTLL-2细胞fas基因的表达及其介导的细胞凋亡抑制作用,探索供者淋巴细胞输注(DLI)时增强T细胞抗白血病的新途径.方法设计并合成抗fas的锤头状核酶基因,将其导入CTLL-2细胞,通过RT-PCR、Western blot和流式细胞仪分别检测核酶对CTLL-2细胞fas mRNA和Fas蛋白表达的抑制,以MTT法检测CTLL-2细胞与Fas抗体结合后的增殖活性,以半胱天冬酶3(caspase-3)活性检测试剂盒检测细胞caspase-3蛋白酶活性,以流式细胞仪检测细胞凋亡,以乳酸脱氢酶法检测CTLL-2细胞的体外杀伤活性. 结果锤头状核酶基因导入CTLL-2细胞后,可使其表面的Fas表达降低达50%,细胞经Fas抗体(JO2)处理后,与空白对照、转染空载体的细胞相比,转染核酶的细胞增殖活性增加了1倍,caspase-3活性降低近50%,而细胞的凋亡率显著降低,只有37%,且CTLL-2细胞的体外杀伤活性为对照组的2倍. 结论该核酶具有切割fas基因的良好活性,并可抑制Fas介导的CTLL-2细胞凋亡,增加该细胞存活率,从而增强对Yac-1细胞的杀伤活性.

不同来源的造血干/祖细胞表面归巢相关分子表达谱的比较研究

目的比较不同来源的造血干/祖细胞表面归巢相关分子(HRM) 表达谱的差异性.方法采用高度灵敏的四色流式细胞术检测脐血(UCB)、动员后的外周血(mPB)及骨髓(BM)来源的造血干/祖细胞表面系列HRM表达水平.结果 UCB、mPB及BM来源的CD34bright细胞均高度表达黏附分子CD44、 CD11a、CD18、 CD62L、CD31及 CD49d; 但UCB来源的CD34bright细胞及CD34brightCD38-细胞黏附分子CD49e、CD49f、CD54及趋化因子受体CXCR-4的表达水平显著低于 mPB及BM来源者;上述不同来源的造血干/祖细胞均不表达其他趋化因子受体,包括CCR-1、CCR-2、CCR-3、CCR-5、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3 及CXCR-5;更为有意义的是,只有mPB来源的CD34bright细胞表达基质金属蛋白酶MMP-2及MMP-9.CD34bright MMP-2+及CD34bright MMP-9+细胞百分率分别为(11.4±4.9)% 及(27.6±7.8)%.结论 UCB来源的造血干/祖细胞低表达或不表达某些HRM,这可能是UCB移植后造血重建延迟的原因之一.

伴有del(11)(q23)和t(6;19)(q16;q13)急性单核细胞白血病一例

患者,男,48岁.因发热1个月,周身浅表淋巴结肿大6 d,于2003年11月6日入院.

hCG/RARα/PLZF转基因小鼠发生髓系增殖性疾病

绝大多数急性早幼粒细胞白血病(APL)患者具有t(15;17)形成的PML/RARα融合基因.另外,约有不到1%的APL临床病例具有t (11;17),形成PLZF/RARα和RARα/PLZF两种融合基因产物.为了从生物整体水平研究RARα/PLZF对生命活动和造血功能的影响,了解APL的发病机制,我们建立了hCG/RARα/PLZF转基因小鼠,并对其白血病发生发展的变化进行了监测.

人间充质干细胞对裸鼠体内造血重建影响的实验研究

间充质干细胞(MSC)是骨髓中除造血干细胞和内皮祖细胞以外的另一种成体干细胞,有广泛的分化潜能,近年来其体内造血支持作用日益受到重视,我们对此进行了研究.

砷剂与化疗双诱导治疗急性早幼粒细胞白血病疗效观察

我们对急性早幼粒细胞白血病(APL)患者应用三氧化二砷(As2O3)同时联合常规化疗方案即双诱导进行诱导缓解期治疗,达到完全缓解(CR)后再用As2O3与不同联合化疗交替进行缓解后治疗,取得较好效果,报告如下.

应用塑料包埋骨髓病理切片免疫组化染色观察血液病患者微血管密度

临床研究证实多数恶性血液系统疾病患者骨髓微血管密度(MVD)增加.但常规塑料包埋骨髓病理切片因其遮蔽骨髓细胞表面的标记抗原,因此不能进行MVD检测,使有关恶性血液病与MVD关系的研究受到限制.我们用丙酮固定、改良的乙二醇-甲基丙烯酸酯(GMA)塑料包埋骨髓活检组织经过抗原修复处理后,通过免疫组化染色良好地标记出骨髓血管内皮细胞,清楚地显现MVD,报道如下.

《中华医学科研管理杂志》进入中国核心期刊2005年变更为双月刊