c-myc在大黄素抑制HL-60细胞增殖及诱导凋亡中的作用

目的研究中药大黄素(emodin)对人髓系白血病细胞株HL-60细胞的影响及探讨c-myc基因在其中的作用.方法应用MTT法绘制细胞生长曲线;细胞集落培养观察大黄素对HL-60细胞增殖的影响;DNA倍体分析、线粒体细胞凋亡检测法、末端缺失原位标记(TUNEL)法及DNA凝胶电泳分析细胞凋亡;RT-PCR及Western blot检测大黄素作用前后c-myc基因mRNA及蛋白表达水平的变化.结果大黄素能明显抑制HL-60细胞增殖,半数抑制浓度(IC5o)约为20μmol/L;DNA片段化、亚G1峰(凋亡峰)的检出及线粒体细胞凋亡检测等证实大黄素能有效诱导HL-60细胞凋亡,细胞凋亡率与药物作用浓度呈正相关.大黄素与HL-60细胞作用后c-myc基因mRNA及蛋白的表达水平与作用时间呈负相关.结论大黄素能有效抑制HL-60细胞增殖,诱导其凋亡;c-myc基因可能参与了大黄素抑制HL-60细胞增殖和诱导凋亡的过程.

白血病患者FLT3基因第二酪氨酸激酶结构域点突变分析

目的研究FLT3基因酪氨酸激酶结构域(TKD)点突变与急性白血病的关系及临床意义.方法采用PCR结合限制性内切酶酶切及序列测定,检测143例急性髓系白血病(AML)、25例急性淋巴细胞白血病(ALL)、2例急性杂合细胞白血病(AHL)、17例骨髓增生异常综合征(MDS)和7例慢性粒细胞白血病-急变期(CML-BC)患者骨髓单个核细胞中FLT3基因外显子20中的TKD点突变,分析其临床相关性.结果143例AML患者中9例(6.3%)存在FLT3-TKD点突变(FLT3-TKD+),阳性率显著低于FLT3基因内部串联重复(ITD)突变(25.9%,P<0.01).FLT3-TKD+存在于AML-M2(3/53)、M3(3/40)、M5(2/23)、M6(1/2)亚型中.2例FLT3-TKD+患者同时存在FLT3-ITD突变,M.M3各1例.在25例ALL、2例AHL、17例MDS和7例CML-BC患者中未检测到FLT3-TKD+.测序分析显示TKD点突变累及密码子D835,未改变FLT3的开放式阅读框架,为错义突变.D835的第1个核苷酸G被T替换,即D835Y.FLT3-TKD+组和FLT3-TKD-组在性别、年龄组成、白细胞计数、骨髓原始细胞比例及化疗缓解率方面差异无统计学意义.结论AML患者中FLT3-TKD点突变的阳性率显著低于FLT3-ITD.TKD点突变累及密码子D835,为错义突变.TKD点突变可单独存在,也可与ITD同时存在.与FLT3-ITD相比,TKD点突变与高白细胞无关.

重组人白细胞介素11治疗急性白血病化疗后血小板减少的疗效和机制研究

目的观察重组人白细胞介素11(rhIL-11)治疗急性白血病(AL)患者化疗后血小板减少的疗效、安全性及其可能的机制.方法AL患者60例,其中32例在化疗结束后BPC≤30×109/L时用rhIL-11治疗,1.5 mg/d皮下注射,连用7～14 d或至血小板较用药前升高50×109/L以上时停药.观察rhIL-11的疗效及不良反应,ELISA法检测用药前血清IL-11水平,RT-PCR法检测单个核细胞IL-11受体α(IL-11Rα)基因的表达,分析三者关系.以28例未用rhIL-11治疗的患者作对照.结果①rhIL-11用药患者组(完全缓解26例,部分缓解2例,未缓解4例)用药后1周、2周血小板计数分别为(63.40±7.24)×109/L、(98.70±9.37)×109/L;对照组(完全缓解20例,部分缓解3例,未缓解5例)为(42.50±6.38)×109/L、(70.30±7.12)×109/L;rhIL-11用药患者组较对照组血小板恢复时间缩短(P<0.05).rhIL-11用药患者组10例需要输注血小板,平均为16～32 U;对照组19例,平均为32～48 U.常见不良反应为轻度乏力、肌肉疼痛,5例出现短暂房性心律失常,减量或停药后消失.显效组用药前平均IL-11水平为(21.81±1.88)ng/L,低于无效组(35.75±2.10)ng/L(P<0.05);其IL-11Rα相对水平为0.3552±0.0224,高于无效组(0.1692±0.0066)(P<0.05).用药前血清IL-11、单个核细胞IL-11Rα水平与血小板计数均无相关性;用药后IL-11水平与骨髓巨核细胞计数无相关性.结论rhIL-11治疗AL患者化疗后引起的血小板减少安全有效;检测用药前血清IL-11水平和单个核细胞IL-11Rα的表达对预测rhIL-11疗效有一定意义.

四色流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病残留细胞

目的探讨利用多参数流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)残留细胞的方法和意义.方法采用四色流式细胞术,以4～6组四色抗体组合检测213例B-ALL患者免疫分型;以CD34、CD10、CD45、CD19为主的2种四色荧光标记抗体组合监测50例297份B-ALL患者骨髓标本微量残留白血病细胞,同时检测分析26份化疗后处于再生期骨髓标本中B祖细胞的免疫表型特点,并以相对定量方法比较了再生期B祖细胞与B系白血病细胞CD10、CD19和CD34表达量的差异.结果213例B-ALL患者中,71.8%患者存在CD45、CD34、CD19、CD10表达量的异常,只存在CD38弱阳性及髓系标志患者占8.1%.微量残留白血病细胞监测的50例患者中,12例患者存在0.06%～7.73%的白血病细胞,其中11例残留白血病细胞以CD45、CD34、CD19、CD10异常表达为主.50例患者中5例临床复发,4例在复发前7～17周微量残留病(MRD)检测阳性,且均>0.1%,1例MRD检测阴性.再生期B祖细胞依据CD45、CD34、CD19、CD10、CD22和CD20表达不同可分为3期.结论多参数流式细胞术检测MRD具有快速、敏感可定量的优势,对白血病复发有更强的预测性.

树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对耐药K562细胞的体外杀伤作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞与同源树突细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性及表型的变化,并观察其对K562、K562/ADM细胞毒作用的影响.方法采集健康供者外周血单个核细胞(MNC)用于诱导培养CIK细胞及成熟DC,将成熟DC和CIK细胞混合培养,用MTT法检测DC-CIK共培养细胞杀伤K562细胞及其耐药株的活性.结果在2.5～20.0效靶比范围内,CIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(20.0±1.2)%～(61.1±2.2)%和(17.5±2.1)%～(45.2±3.3)%;DC-CIK共培养细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(25.2±2.3)%～(70.9±4.1)%和(22.4±2.7)%～(62.3±5.0)%.CIK细胞对K562敏感株和耐药株杀伤率的差异无统计学意义,DC-CIK细胞对敏感株和耐药株的杀伤作用差异亦无统计学意义;DC-CIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤活性均高于单纯CIK细胞组,差异有统计学意义(P<0.05).结论DC与CIK共培养细胞的增殖活性和细胞毒活性高于CIK细胞.

抗P-gp/抗CD3双功能抗体在裸鼠体内介导人T细胞杀伤白血病耐药细胞

目的研究抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体介导T细胞对白血病耐药细胞的特异性靶向杀伤活性.方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Western blot及活细胞间接免疫荧光法鉴定纯化产物;采用人白血病耐药及敏感裸鼠移植瘤模型测定该微型双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性.结果纯化的抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体具有与Jurkat(CD3阳性)和K562/A02细胞(P-gp阳性)的结合活性,结合阳性率分别为86.25%,86.26%;在对人白血病裸鼠移植瘤模型的生物治疗中,抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体能有效抑制耐药白血病移植瘤的生长,抑瘤率98.57%.结论抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体在体外及动物肿瘤模型实验中能介导人T细胞有效杀伤表达P-gp抗原的耐药肿瘤细胞,具有潜在的临床应用前景.

CD34、CD14、CD10、CD31和因子Ⅷ在人胚胎卵黄囊血岛、AGM区和肝造血细胞中的表达

目的研究CD34、CD31、CD14、CD10和凝血因子Ⅷ(FⅧ)在人胚胎发育第3～12周卵黄囊血岛、PAS/主动脉-生殖腺-中肾(AGM)区和肝造血细胞的表达.方法药物流产受精龄3～12周人胚胎共32例,石蜡包埋切片,苏木精-伊红和免疫组化染色,光镜观察.结果第3～4周人胚卵黄囊血岛由外周的血管内皮细胞和中心的造血细胞组成.血岛的血管内皮细胞和造血细胞均为CD10、CD14、CD31和FⅧ表达阳性.此外,血管内皮细胞还表达CD34,而造血细胞为CD34阴性.第32天,卵黄囊血岛的造血细胞已经迁移.在第4周,主动脉、中肾和肝造血灶内开始出现CD34、CD10、CD14、CD31和FⅧ阳性的造血细胞.到第7周,CD10、CD14阳性细胞数量达到高.到第11～12周,上述各区域中多为无核的红细胞,CD34、CD10、CD14、CD31和FⅧ表达为阴性.第4～12周,胚体内所有血管内皮细胞均为CD34阳性.结论卵黄囊血岛造血细胞和内皮细胞共表达CD10、CD14、CD31和FⅧ,卵黄囊血管内皮细胞表达CD34,而造血细胞不表达CD34.背主动脉、中肾和肝的造血细胞主要在第4～7周表达CD34、CD10、CD14、CD31和FⅧ.抗CD34抗体可标记人胚胎3～12周各种血管的内皮细胞.

RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr/abl融合基因表达的抑制作用.方法体外化学合成针对bcr/abl融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株,以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照;同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照,流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率;实时定量RT-PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应.MTF法检测细胞增殖抑制率.膜联蛋白Ⅴ(An-nexin Ⅴ)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率.结果电穿孔的转染效率可达70%;化学合成的siRNA可以抑制bcr/abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达;特异性siRNA可以抑制细胞增殖,转染24 h细胞增殖抑制率达47%,48 h达56%;特异性siRNA转染细胞24 h组凋亡率为15.05%,48 h组为19.47%,与对照组(1.00%)比较明显提高.结论在细胞水平上,化学合成的siRNA可以抑制bcr/abl融合基因的表达,为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础.

Mcl-1基因在HL-60细胞对全反式维甲酸耐药机制中的作用

目的探讨髓系白血病-1(Mcl-1)基因在HL-60细胞对全反式维甲酸(ATRA)耐药中的作用.方法采用少量、递增、反复ATRA诱导HL-60细胞,建立ATRA耐药细胞系HL-60/ATRA;利用鸡尾酒法制备Mcl-1基因的小片段干扰RNA(Small interference RNA,siRNA),并通过脂质体介导将其导入HL-60/ATRA细胞;Western blot检测Mcl-1蛋白在细胞中的表达;MTT实验、NBT还原反应实验、TUNEL免疫组化染色法分别检测细胞的增殖、分化和凋亡情况.结果HL-60/ATRA细胞Mcl-1蛋白相对灰度值为0.624±0.127,较野生型HL-60细胞(相对灰度值为0.162±0.127)明显高表达,并可耐受100 nmo/L的ATRA,而不发生分化、凋亡[凋亡率为(1.0±0.5)%];Mcl-1 siRNA导入HL-60/ATRA细胞后,Mcl-1蛋白表达下调(相对灰度值为0.267±0.086),恢复对ATRA的敏感性[凋亡率为(18.5±4.5)%].结论Mcl-1基因可能参与了HL-60细胞ATRA耐药的形成;抑制Mcl-1基因可能成为一种新的逆转ATRA耐药的策略.

骨髓间充质干细胞对体外分化的原态(naive)T细胞分泌细胞因子的影响

目的观察骨髓间充质干细胞(MSC)对原态(naive)T细胞的反应,探讨其免疫调节机制.方法传代培养3代的MSC经60Co照射后与脐血CD34+细胞分化产生的原态T细胞共孵育1周,用ELISA方法检测培养上清细胞因子的变化.结果孵育7 d后,与MSC共孵育后T细胞数量明显增加,为(9.15±0.68)×105/孔,而原态T细胞单独培养组为(4.87±1.33)×105/孔(P<0.05);ELISA检测共孵育组IFN-γ分泌减少为(1.147±0.181)pg/ml,而原态T细胞单独培养组为(4.897±0.189)pg/ml、共孵育组IL-2分泌增加为(16.141±2.729)pg/ml,而原态T细胞单独培养组为(2.551±0.460)pg/ml,未检测到IL-4和IL-10.结论MSC有一定的抗原性,与MSC共孵育导致原态T淋巴细胞增殖,MSC可能通过直接或间接抑制T细胞产生IFN-γ发挥免疫抑制作用.为进一步阐明MSC免疫调节机制提出新的线索.

高原健康人及高原红细胞增多症患者血浆蛋白C、蛋白S的变化

我们利用ELISA法测定高原健康人及高原红细胞增多症(HAPC)患者血浆蛋白C(PC)、蛋白S(PS)含量,分析PC、PS在高原健康人及HAPC患者凝血/抗凝血平衡中所起的作用,探索性研究低氧与抗凝系统变化的关系.

微分化急性髓系白血病四例报告

微分化急性髓系白血病(AML-Mo)是一种少见的AML,随着细胞免疫学的发展,特别是单克隆抗体在临床的广泛应用,越来越多的AML-Mo病例被诊断,对AML-Mo的诊断和治疗问题也越来越受重视.现总结上海市中美合作课题组在2003年5月到2004年5月诊断的4例AML-Mo病例资料.并对AML-Mo的诊断标准作一复习.

赛莱昔布对K562细胞的增殖抑制作用与细胞G1/S期受阻及细胞周期蛋白表达的相关性

赛莱昔布(Celecoxib)是一种环氧化酶-2(COX-2)特异性抑制剂.目前,国内外对于COX-2特异性抑制剂抗肿瘤作用的研究主要集中在实体肿瘤,而对造血系统恶性肿瘤的研究少有报道.为探讨赛莱昔布对慢性粒细胞白血病(CML)细胞增殖的影响,我们以不同浓度的赛莱昔布干预CML急变细胞株K562细胞,观察药物对K562细胞增殖和细胞周期的影响,并分析赛莱昔布作用下的K562细胞周期调节蛋白Cy-clin D1、Cyclin E、P16INK4a和P21表达的变化,现将结果报道如下.

PTD-BCR/ABL-OD融合癌蛋白的表达和跨膜转运

寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)是BCR/ABL融合蛋白N端的一个重要结构域,是2个单体通过N末端螺旋易位,然后在C末端螺旋间形成反向卷曲折叠形成二聚体,进而互相叠套形成四聚体.在几种不同类型的Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病(CML)患者中可以观察到这种四聚体的形成,它能介导BCR/ABL融合蛋白多聚体的形成,进而使无活性的ABL蛋白的酪氨酸激酶活化[1,2].因此,如果能够利用外源性的OD结构域蛋白干预内源性蛋白的聚合,从而达到抑制BCR/ABL蛋白激酶活化的作用.我们在以前工作的基础上,采用PCR扩增OD区基因片段,并在其N端融合蛋白转导结构域(PTD)基因后,构建原核表达载体,然后在大肠杆菌中进行表达.纯化表达的融合蛋白,并加入到培养的K562细胞中,对OD结构域蛋白在细胞中的作用进行了初步探讨.

侵袭性系统性肥大细胞增多症一例

患者,男,48岁.因头昏、乏力、面色苍白、全身密布皮下出血点、齿龈出血,于2004年3月25日入院.入院前曾在外院经骨髓检查诊断为再生障碍性贫血,用十一酸睾丸素、利血生、皂矾丸等治疗,但病情进行性加重而转入我院治疗.

以嗜酸粒细胞增多及多发性骨质破坏为突出表现的组织细胞肉瘤一例

患者,男,28岁.因反复发热,嗜酸粒细胞显著增高,肝、脾肿大1.5年,腰背部疼痛1年入院.患者于入院前1.5年无明显诱因发热,初为低热,逐渐升高达40℃,并伴有畏寒.血常规:Hb 75g/L,WBC 9.8×109/L,中性粒细胞0.106,嗜酸粒细胞0.722,淋巴细胞0.172,BPC 49×109/L.彩色超声检查:肝、脾肿大.骨髓涂片:有核细胞增生明显活跃,以粒系增生为主,嗜酸粒细胞占0.490(其中嗜酸中幼粒细胞0.090,嗜酸晚幼粒细胞0.190,嗜酸杆状核细胞0.120,嗜酸分叶核细胞0.090),形态正常,原始细胞0.010.染色体核型:46,XY.bcr/abl融合基因阴性.给予羟基脲及甲泼尼龙治疗,体温恢复正常.

HLA半相合造血干细胞移植的研究进展

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前治疗多种恶性血液系统疾病、免疫缺陷性疾病以及某些遗传代谢性疾病的有效手段.人类主要组织相容性抗原(HLA)相合的亲缘相关或无关供者是allo-HSCT合适的供者.然而,仅有25%～30%的患者能找到HLA相合的亲缘供者;在无关人群中找到相合供者的概率是1/5万～1/10万,甚至更低.若进行HLA半相合HSCT,则有90%的患者能够找到供者,可为更多需接受移植治疗而无HLA相合供者的患者带来福音.

Wnt基因对造血干细胞增殖、分化调控的研究进展

1982年Nusse首次从小鼠乳腺癌中克隆出了Wnt基因.目前,已从不同物种如线虫、斑马鱼、鸡、青蛙、鼠及人类中分离出许多的Wnt基因,这些基因共同组成了Wnt家族.不断的研究表明,Wnt通过复杂的信号传递通路控制着胚胎早期的发育,卵裂、背腹形成,并对细胞分化、细胞增殖及生长有调节作用.近来研究证明,Wnt基因对造血干细胞也有重要的调控作用.

血液病诊疗进展学习班通知

基金项目或攻关项目内容来稿须附证明材料的通知