腺病毒受体在不同白血病细胞中的表达及意义
摘要： 高效转移目的基因进入细胞,尤其是处于非分裂静止期的细胞,是基因治疗至关重要的步骤.由于腺病毒载体(Ad-Vec)具有制备简便、宿主范围广、感染性强、包装容量大、病毒繁殖滴度高和安全性好的特点,因此,AdVec已成为继逆转录病毒载体后被广泛应用的载体系统.然而,我们以往的研究发现,传统的以5型腺病毒为基础构建的AdVec即AdSVec很难高效感染多种不同的白血病细胞如K562细胞,但是,它们均能被新型嵌合的AdVec即Ad5F35AdVec有效感染[1].为进一步探讨其机制,我们分析了腺病毒受体(CAR)在不同白血病细胞中的表达.
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霍奇金淋巴瘤的免疫表型与鉴别诊断
目的研究霍奇金淋巴瘤(HL)的免疫表型和鉴别诊断.方法采用SP免疫组化法检测56例HL患者瘤细胞及背景细胞的免疫表型,根据WHO 2000淋巴瘤新分类重新评价.结果 HL患者47例,其中结节性淋巴细胞为主型HL(NLPHL) 2例,经典型HL(CHL)43例,未分类2例;富于T细胞的B细胞淋巴瘤(TCRBCL) 6例,间变性大细胞淋巴瘤(ALCL) 2例以及转移性肿瘤1例.NLPHL中L&H细胞呈CD20(+),CD15(-),CD30(-);背景细胞中TIA-1阳性细胞稀少,CD57阳性细胞多见.CHL中诊断性R-S细胞及变异型R-S细胞呈CD15(+)(81%),CD30(+)(100%),其中3例共同表达CD20呈弱阳性;背景细胞中TIA-1阳性细胞多见,而CD57阳性细胞稀少.TCRBCL中瘤细胞呈CD20(+),CD15(-),CD30(-);背景细胞中TIA-1阳性细胞增多,CD57阳性细胞少见.ALCL中瘤细胞呈CD3(+),CD30(+),ALK-1(+),CD15(-),CD20(-),背景细胞中TIA-1阳性细胞多见,CD57阳性细胞少见.结论石蜡免疫组化检测瘤细胞CD20、CD3、CD15、CD30以及背景细胞TIA-1、CD57、CD20和CD45RO的表达,有助于HL的诊断和鉴别诊断.
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t(12;21)儿童急性淋巴细胞白血病的研究
目的研究t(12;21)儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的临床与预后特征.方法应用常规核型分析(CCA)、双色间期荧光原位杂交(I-FISH)和RT-PCR技术,对51例ALL患儿骨髓或外周血有核细胞进行t(12;21)和TEL-AML1融合基因检测.结果 11例患儿存在t(12;21),占儿童初治ALL的21.6%,占非T细胞系ALL的26.9%(41例中11例);中位发病年龄6.8岁(2.9～12.0岁);非T细胞系免疫表型,以普通型ALL为主,不伴髓系抗原高表达;CCA检测核型多正常,仅1例有t(12;21);72.7%的患儿伴TEL等位基因缺失.与其他儿童非T细胞系ALL相比,t(12;21)患儿的血小板计数和IgH重排发生率低;男女性别比、初诊时贫血、出血、器官肿大程度、白细胞计数和完全缓解(CR)率、4周内达CR比例、持续CR时间及复发率未见显著差异.结论 t(12;21)是我国儿童ALL常见的染色体易位.为非T细胞系免疫表型,以普通型ALL为主,多伴TEL等位基因丢失.临床表现和近期疗效与其他非T细胞系儿童ALL无显著差异.与国外报道相比,患儿的发病年龄偏大,血小板计数和IgH重排率低,核型多为正常.
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骨髓增生异常综合征细胞周期调控基因表达谱的研究
目的研究骨髓增生异常综合征(MDS)细胞周期调控基因的异常表达.方法通过半定量RT-PCR分析29名正常对照、27例MDS和19例原发性急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞周期素(cyclins)家族(cyclin D2,cyclin D3,cyclin A1和cyclin E)、细胞周期素依赖性激酶(CDKs)家族(CDK2,CDK4和CDK6)、CDKs抑制剂家族(p21,p27和p57)以及Rb-E2Fs通路中Rb和E2F1基因的表达率和表达量.结果MDS组cyclin D3和cyclin A1基因表达量(分别为0.65±0.17,0.48±0.04)均明显高于正常对照(0.49±0.04,0.32±0.06),且低于原发性AML组(0.84±0.15,0.65±0.09)(P值均＜0.05).MDS组cyclin D2和cyclin E基因表达率(表达量)分别为40.7%(0.78±0.21)和51.9%(0.52±0.10),均明显高于正常对照[13.8%(0.49±0.09);17.2%(0.33±0.13)]和原发性AML组[10.5%(0.38+0.08);21.1%(0.33±0.03)].MDS组CDK2基因表达量(0.66±0.19)明显高于正常对照(0.42±0.04)(P＜0.001),而且CDK6基因表达率(25.9%)明显高于正常对照(3.4%)(P＜0.05).MDS组、原发性AML组及正常对照组CDK4基因表达率和表达量差异无统计学意义.MDS组p21基因(77.8%;1.18±0.21)和p27基因(48.1%;1.14±0.40)有较高的表达率和表达量,明显高于正常对照和原发性AML组.MDS组p57基因表达量(0.69±0.06)明显高于正常对照(0.53±0.05)(P＜0.001),却低于原发性AML组(0.96±0.16)(P＜0.01).MDS组Rb基因表达率(55.6%)和表达量(0.85±0.17)高,明显高于正常对照和原发性AML组.MDS组E2F1基因表达率(7.4%)和表达量(0.39±0.04)与正常对照接近而明显低于原发性AML组.结论MDS细胞周期调控基因cyclins家族基因、CDK2和CDK6基因高表达,这可能与MDS骨髓造血细胞高增殖有关;p21和p27基因高表达,这可能与MDS高增殖骨髓造血细胞G1期阻滞有关.
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受体蛋白质酪氨酸激酶和血管内皮生长因子在人胚胎卵黄囊和胎肝中的表达
目的研究人胚胎发育不同时期卯黄囊和胎肝内受体酪氨酸激酶(KDR)、血管内皮生长因子(VEGF)和CD34的分布及表达,为胚胎造血分化提供理论依据.方法取15份不同胎龄的胎儿卯黄囊和胎肝,固定、切片,进行免疫组织化学SP法染色,观察KDR、VEGF和CD34的表达及分布.结果在卵黄囊和胎肝中均有KDR+、VEGF+和CD34+细胞.在中期胎肝组,KDR和VEGF的灰度值分别为103.8±6.1和96.4±6.3,表达强于晚期胎肝组(KDR和VEGF的灰度值分别为90.4±6.0和87.4±6.3)(P＜0.05),KDR与VEGF的表达具有一定相关性(P＜0.05).结论KDR和CD34在胎肝和卵黄囊中广泛表达,提示在胎肝和卯黄囊中可能有成血管血液干细胞存在,KDR和VEGF相互作用,可能介导成血管血液干细胞的存活、扩增和分化.
关键词： 受体蛋白质酪氨酸激酶 内皮生长因子 卵黄囊 肝 胚胎 -
L-精氨酸对人凝血因子Ⅷ基因表达的影响
目的 研究L-精氨酸对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因转录及表达的影响.方法 将B结构域(氨基酸760～1639)缺失的人FⅧcDNA(BDDhFⅧcDNA)插入至质粒载体pcDNA6/V5-HisA,构建重组载体pcDNA6/V5-HisA-BDDhFⅧ,转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),加入L-精氨酸(终浓度10mmoL/L)培养72 h后,用ELISA方法检测细胞上清液中的人FⅧ抗原(FⅧ:Ag),一期凝血酶法检测FⅧ的促凝活性(FⅧ:C).用Nonhem blot检测HUVEC中人FⅧ基因的转录.用PCR扩增BDDhFⅧcDNA的A1、A2、A3、C1和C2结构域基因,分别插入至pcDNA6/V5-HisA,构建五种载体pcDNA6/V5HisA-BDDhF Ⅷ-A1、pcDNA6/V5-BDDhF Ⅷ-A2、pcDNA6/V5-HisA-BDDhF Ⅷ-A3、pcDNA6/V5-HisA-BDDhFⅧ-C1和pcDNA6/V5-HisA-BDDhF Ⅷ-C2,分别转染HUVEC后,加入L-精氨酸(终浓度10 mmol/L)培养72 h.膨胀裂解法分离细胞核,进行细胞核连缀(Run-on)反应,狭线印迹杂交检测A1、A2、A3、C1和C2结构域基因的转录.结果 经L-精氨酸诱导后,HUVEC中人FⅧ基因表达明显增强[FⅧ:Ag为(146.08±4.78)ng/ml,106细胞诱导24 h后FⅧ:C为(0.752±0.009)U/ml],约是未经L-精氨酸诱导[FⅧ:Ag为(34.66±3.98)ng/ml,106细胞诱导24 h后FⅧ:C为(0.171±0.006)U/ml]的4倍(P＜0.01).Northern blot检测显示,加L-精氨酸培养之后,HUVEC中人BDDFⅧmRNA的转录也较未加L-精氨酸显著增强,而只转染pcDNA6/V5-HisA的HUVEC中无人BDDFⅧmRNA的转录存在.Run-on及狭线印迹杂交显示,加L-精氨酸培养后,A1和A2结构域基因的转录均较未经L-精氨酸诱导者明显增强,也显著强于A3、C1和C2结构域基因的转录,而A3、C1和C2结构域基因的转录在L-精氨酸诱导前后均无明显变化.结论 L-精氨酸通过促进人FⅧ的A1和A2结构域基因的转录进而增强FⅧ在体外的转录和表达,因而在血友病A的基因治疗研究中,L-精氨酸是一个很有前途的诱导FⅧ转录和表达的物质.
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利妥昔单抗联合化疗一线治疗初治弥漫大B细胞淋巴瘤的临床现状
目的 通过前瞻性、非干预性的多中心临床研究观察中国真实医疗环境中利妥昔单抗联合化疗(R-Chemo)作为一线方案治疗弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的现状.方法 研究为单组、前瞻性、观察性、Ⅳ期临床试验.纳入国内24个中心279例CD20阳性初治DLBCL患者,无特定的排除标准.采用以利妥昔单抗为基础的免疫化疗,如R-CHOP(利妥昔单抗+环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松)方案,但组合的化疗方案不限于CHOP方案.治疗策略由医师和患者决定,疗程、剂量、给药间隔时间及检查等不做明确规定.所有患者在结束后1次利妥昔单抗治疗后再观察120 d.结果 279例患者中至少接受1个周期利妥昔单抗治疗且至少完成1次肿瘤评估者258例,其中男148例,女110例,中位年龄57.2(12.8～88.4)岁,91.1％患者ECOG评分介于0～1分,76.4％的患者国际预后指数介于低危至低中危,69.0％患者淋巴瘤长径＜7.5 cm.患者完成免疫化疗的中位疗程数为6个,中位疗程间隔时间为24.4 d.患者接受利妥昔单抗为基础的一线诱导治疗后,总有效率达94.2％;主要不良事件为贫血、骨髓功能衰竭、白细胞及血小板减少、消化系统疾病、感染和肝脏毒性等,所有不良事件可控.结论 非干预性临床试验真实地再现了R-Chemo方案是治疗初治DLBCL患者有效的一线方案,且不良事件可控.治疗现状与国际指南推荐的类似.
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13-顺式维甲酸联合干扰素α2b对套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1细胞作用及其机制的体外研究
目的：探讨13-顺式维甲酸/异维甲酸（13cRA）、干扰素α2b（IFN-α2b）单独及联合应用对套细胞淋巴瘤（MCL）细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用及其机制。方法13cRA、IFN-α2b单独及其联合应用于MCL细胞株Jeko-1细胞，应用CCK-8法检测不同药物处理方案对细胞增殖的影响， AnnexinⅤ/PI双重染色法检测其对细胞凋亡的影响，流式细胞术（FCM）检测其对细胞周期的影响， Western blot法检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）及凋亡途径相关蛋白caspase-9、Rb的表达。结果①单用13cRA、IFN-α2b及联合应用均对Jeko-1细胞增殖有抑制和诱导凋亡作用（P值均<0.05）；13cRA （100μmol/L）+IFN-α2b（10000 IU/ml）联合组对细胞的增殖抑制率在第1天为（69.37±8.31）%，细胞凋亡率在第5天为（99.87±0.12）%（联合用药协同系数为0.735），均高于阳性对照组的（63.34±4.22）%和（87.80±3.22）%，差异均有统计学意义（P值均<0.05）；抑制增殖与促凋亡作用均呈药物浓度和时间依赖性，并引起G1期+G2期细胞比例的明显增加（P<0.05），S期细胞明显减低（P<0.05）。②单用13cRA、IFN-α2b及联合应用均能下调Jeko-1细胞Cyclin D1及Rb蛋白的表达水平，促进caspase-9裂解。结论单用13cRA、IFN-α2b及联合应用均对Jeko-1细胞有抑制增殖和诱导凋亡效应，可降低S期细胞比例，使细胞停滞于G1、G2期，两药联合应用有协同作用；其作用可能与下调Cyclin D1、Rb蛋白的表达水平及激活caspase-9有关。
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异基因造血干细胞移植术后继发性造血细胞减少的危险因素分析
目的 探讨异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后100天(+100 d)内继发性造血细胞[白细胞和(或)血小板]减少的发生率及其危险因素.方法 回顾性分析2006年1月1日至2008年1月1日北京大学血液病研究所260例(包括单倍体相合160例和HLA全合100例)allo-HSCT患者的临床资料.根据移植后造血重建情况,将患者分为①继发性白细胞减少组;②继发性血小板减少组;③继发性植入功能不良组.分析各组患者的发生率及其危险因素.结果 在+100 d内,单倍体相合移植组继发性白细胞减少(38.8％对18.0％,P=0.0005)和继发性血小板减少(25％对12％,P=0.01)的发生率均高于HLA全合移植组,两组间继发性植入功能不良(5.6％对2.0％)的发生率差异无统计学意义(P=0.21).多因素分析显示,CMV感染是导致继发性白细胞减少的独立危险因素;移植物抗宿主病(GVHD)及CMV感染是导致继发性血小板减少的独立危险因素;CMV感染是导致继发性植入功能不良的独立危险因素.结论 单倍体相合造血干细胞移植后继发性造血细胞减少较HLA全合移植更为常见,可能与单倍体相合造血干细胞移植后GVHD及CMV感染发生率较高有关.
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异硫氰酸苯己酯对K562/G01细胞伊马替尼耐药性的影响
目的 体外观察异硫氰酸苯己酯(PHI)对人慢性髓性白血病细胞株K562/G01细胞伊马替尼耐药性的影响,探讨其可能的机制.方法 采用MTT法检测不同浓度的PHI和伊马替尼单独或联合处理对K562/G01细胞增殖的抑制作用.流式细胞术检测不同浓度的PHI和(或)伊马替尼作用下K562/G01细胞的凋亡率.Western blot检测PHI处理K562/G01细胞后P-gp、P210bcr-abl蛋白、磷酸化P210bcr-abl蛋白(p-P210bcr-abl)表达水平的变化.结果 PHI单独处理24 h可抑制K562/G01细胞增殖,诱导细胞凋亡.PHI浓度由0增至40 μmol/L,细胞增殖抑制率由0增至(51.22±1.41)%,凋亡率由(3.76±1.46)%增至(35.35±3.70)%.浓度分别为10、20、40 μmol/L的PHI与不同浓度伊马替尼联合处理后,伊马替尼的IC50分别为(10.49±1.24)、(6.33±1.42)、(0.85±0.17)μmol/L.PHI 20 μmol/L和浓度为10、20 μmol/L的伊马替尼分别共同作用24 h后,K562/G01细胞凋亡率分别为(43.62±4.23)%和(55.41±4.35)%,较单用伊马替尼组及单用PHI组均明显升高.PHI浓度由0增至40 μmol/L分别作用7 h后,K562/G01细胞P210bcr-abl/β-actin比值由0.944±0.034降至0.392±0.025,p-P210bcr-abl/β-actin比值由0.906±0.019降至0.361±0.021,但P-gp表达无明显变化.结论 PHI能抑制K562/G01细胞增殖,诱导细胞凋亡.PHI与伊马替尼联合有协同作用,可部分逆转细胞对伊马替尼的耐药,其机制可能与抑制P210bcr-abl和p-P210bcr-abl蛋白表达有关.
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健康供者特征对rhG-CSF预激的骨髓采集物CD34+细胞和T细胞亚群的影响
目的 探讨健康供者特征对rhG-CSF预激的骨髓(G-BM)采集物造血和免疫细胞成分的影响.方法 150名健康供者体内应用rhG-CSF 5 μ·kg-1·d-1连续4～5 d,第4,5天采集骨髓和外周血,用流式细胞术测定G-BM采集物中的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD14+、CD34+细胞以及CD3+CD4-CD8-调节性T细胞的数量,并分析供者性别、年龄、体重、是否妊娠等特征对G-BM成分的影响.结果 150名健康供者G-BM所含有核细胞,淋巴细胞,CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD14+、CD34+细胞以及CD3+CD4-CD8-调节性T细胞的中位值分别为31 050(12 200～58 100)、2122(506～6618)、1344(307～4791)、692(145～3038)、616(112～2575)、986(265～2958)、63(11～505)和83(9～390)/μl.年龄≤38岁的供者G-BM中的有核细胞、CD34+细胞以及CD3+ CD4-CD8-调节性T细胞的数量分别为33800(18600～57100)、76(22～505)和97(11～380)/μl,显著高于年龄＞38岁的供者[分别为28 000(12 200～58 100)、49(11～220)和65(9～389)/μl],P值分别为＜0.05,＜0.001和0.001.外周血单核细胞计数＞0.37×109 /L的供者G-BM中有核细胞的数量[33550(12 200～57 100)/μl]显著高于≤0.37×109 /L的供者[27 150(13 800～58 100)/μl](P=0.005).多因素分析显示年龄和外周血单核细胞是G-BM中有核细胞采集量的影响因素[HR值分别为0.41和2.87;P值分别为0.01和0.003];年龄是G-BM中CD34+细胞采集量的唯一影响因素(HR=0.26;P值=0.001);年龄还是G-BM中CD3+ CD4-CD8-调节性T细胞数量的影响凶素[HR值为0.31;P=0.001].结论 年龄是影响G-BM中有核细胞、CD34+细胞和CD3+ CD4-CD8-调节性T细胞采集数量的因素,年龄≤38岁的供者更易采集满足临床需要的有核细胞和CD34+细胞;外周血单核细胞＞0.37×109 /L的供者采集的G-BM含有较多数量的有核细胞.
