晚期肺癌患者凝血-纤溶系统的变化及化疗对其的影响
摘要： 目的 探讨尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator,uPA)系统在肺癌患者中的变化,分析并评价其与肺癌患者预后的关系.方法 记录肺癌患者化疗前、后及对照组的凝血指标,并用ELISA法检测各组外周血uPA、组织型纤维蛋白溶酶原激活物(tissue-type Plasminogen Activator,tPA)、纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物-1(Plasminogen Activator Inhibitor-1,PAI-1)浓度.结果 (1)肺癌患者化疗前(A1组)、化疗2周期后(A2组)上述各项凝血-纤溶指标均显著高于正常对照组(B组)(P均＜0.05);(2)A1组与A2组之间的凝血指标血小板计数(platelet count,PC)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)虽然存在差别,但差别不具有统计学意义(P均＞0.05),化疗2周期后的D-二聚体(D-dimer)、tPA、uPA、PAI-1均显著高于化疗前(P均＜0.05);(3)分层分析表明:A2组中治疗进展病例的uPA和D-dimer显著高于临床获益病例(P均＜0.05); (4)化疗前、后有显著变化的纤溶指标uPA与D-dimer、tPA、PAI-1之间均有直线正相关性(0.472、0.624、0.575、P均＜0.01),tPA与PAI-1也具有直线正相关关系(r=0.61,P＜0.001).结论 (1)肺癌患者存在凝血-纤溶系统紊乱,化疗可以加重这一异常,且纤溶系统变化更为敏感;(2)血浆低水平的uPA和D-dimer的肺癌患者有较好化疗效果,且两者存在正相关关系,因此两者可能成为提示肺癌患者预后的指标.
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siRNA干扰VRK1表达对食管癌细胞BANF1蛋白表达及增殖迁移能力的抑制作用
目的 探讨小干扰RNA干扰VRK1表达对食管癌细胞株BANF1蛋白的表达及其增殖迁移能力的影响.方法 将VRK1 siRNA转染EC109和EC1细胞系干扰VRK1的表达,Western blot法检测VRK1siRNA干扰效率及siRNA干扰后食管癌细胞BANF1的表达.CCK-8实验和流式细胞术检测干扰VRK1表达后对细胞增殖能力的影响,Transwell细胞体外侵袭实验观察干扰前后细胞迁移能力的改变.结果 两株食管癌细胞VRK1 siRNA转染后,转染实验组VRK1蛋白表达分别下调62.40％和52.14％,同时BANF1蛋白表达分别下调24.51％和52.87％.转染12h后,细胞增殖开始受到抑制,36h抑制率高,分别达19.41％、20.10％.VRK1和BANF1表达下调后,G1、G2期细胞比例下降,S期细胞比例上升.实验组细胞迁移个数下降,细胞迁移数和对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 siRNA干扰VRK1表达后可降低食管鳞癌细胞BANF1蛋白的表达,使食管鳞癌细胞增殖周期阻滞在DNA合成期,分裂期细胞比例下降,抑制其增殖及迁移能力.
关键词： 食管鳞状细胞癌 牛痘病毒相关性激酶1 屏障自整合因子1 -
宫颈癌中卵泡抑素样蛋白过表达对下游基因的影响及生物信息学分析
目的 利用基因芯片技术对卵泡抑素样蛋白(FSTLI)下游基因及信号转导通路进行生物信息学分析,探讨FSTL1在宫颈癌中的调控机制.方法 采用基因芯片筛选转染FSTL1后HeLa细胞中的差异表达基因;运用生物信息学分析方法寻找FSTL1在宫颈癌中的差异表达基因及调控机制;用反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)对29个差异表达基因加以验证.结果 与阴性对照组相比,实验组中有881个差异表达基因,这些差异表达基因主要富集在转录调控、细胞增殖、凋亡、黏附等生物学过程以及癌症的转录误调节、丝裂源活化的蛋白激酶(MAPK)、P53等信号通路;RT-qPCR验证结果显示FSTL1上调PI3K/AKT/Bax/Bcl-2和P53信号相关通路因子,这与基因芯片结果基本符合.结论 FSTL1的差异基因富集于转录调控、细胞增殖、凋亡、黏附等生物学过程,可能通过调控PI3K/AKT/Bax/Bc1-2和P53信号通路来参与宫颈癌的发生发展.
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二甲双胍对人食管鳞癌侧群细胞的作用及机制
目的 探讨二甲双胍(metformin,Meff)对人食管鳞癌侧群(side population,SP)细胞的作用及机制.方法 通过流式细胞仪检测食管鳞癌细胞系SP比例及分选SP细胞,CCK-8法、平板克隆及成球实验检测Metf对SP细胞体外增殖的影响,Western blot法检测Metf时SP细胞相关基因蛋白表达的影响.结果 本实验中的9种食管鳞癌细胞系的SP比例在0.2％～2％左右.Metf能够降低KYSE 150 SP比例、明显抑制SP细胞的细胞增殖、克隆形成数和成球生长数,其抑制程度与Metf浓度及给药时间呈显著正相关性,差异有统计学意义(P＜0.01).此外,Metf能不同程度地降低SP细胞中相关“干性”基因SOX2与OCT4的表达.结论 Metf能抑制食管癌细胞中SP细胞,可能为食管癌治疗与预防提供新的途径.
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异黏蛋白调控鼻咽癌细胞增殖及紫杉醇耐药的研究
目的 探讨异黏蛋白(Metadherin,MTDH)对鼻咽癌细胞增殖及紫杉醇耐药的影响.方法 采用慢病毒介导的MTDH cDNA和MTDH-shRNA转染鼻咽癌细胞,分别上调和抑制MTDH的表达.CCK-8法、流式细胞实验分别检测细胞增殖能力、细胞周期及凋亡改变.CCK-8法确定紫杉醇对鼻咽癌细胞的IC30、IC50、IC70,并检测IC30、IC50、IC70浓度下MTDH过表达组与沉默组细胞生存率改变.结果 MTDH上调后5-8F、HNE-1细胞的增殖能力均增强,而沉默MTDH后细胞的增殖能力均降低.MTDH沉默组的G1期细胞比例明显增加.MTDH过表达组细胞凋亡率降低,MTDH沉默组细胞凋亡率增加.MTDH表达上调之后,鼻咽癌细胞对紫杉醇的敏感度降低,在IC70、IC50浓度下,MTDH过表达组细胞的生存率高于对照组细胞.沉默MTDH之后,鼻咽癌细胞对紫杉醇的敏感度升高,在IC50、IC30浓度下,MTDH沉默组细胞的生存率低于对照组细胞.结论 MTDH在促进鼻咽癌细胞增殖中起重要作用,其高表达可促进鼻咽癌细胞紫杉醇耐药性的产生.
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抗CEA和CA19-9的单链抗体在HEK293细胞中的融合表达及亲和力鉴定
目的 在HEK293细胞中高效表达抗CEA scFv和抗CA19-9 scFv两种单链抗体的Fc融合蛋白(anti-CEA scFv-Fc和anti-CA19-9 scFv-Fc),并测定两种单链抗体亲和力.方法 从GenBank中获取两种scFv基因序列;经优化后合成,并与pET32a(+)构成原核表达载体anti-CEA scFv/pET32a(+)和anti-CA1 9-9 scFv/pET32a(+),在E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达;两种scFv经PCR扩增技术删除末端终止序列,利用重叠区基因扩增法在anti-CEA scFv上游加入人IL-2信号肽,分别与含人IgG Fc段基因的pTT5载体(Fc/pTT5)构成真核表达载体(anti-CEA scFv(-t)-Fc/pTT5、IL2-anti-CEA scFv(-t)-Fc/pTT5和anti-CA19-9 scFv(-t)-Fc/pTT5);使用脂质体转染法,将3个重组质粒转入HEK293细胞中进行表达;产物经rProtein-A FF亲和层析纯化,竞争性细胞ELISA和Western blot检测.结果 免疫印迹显示,3个scFv-Fc融合蛋白均在HEK293细胞中表达;竞争结合实验表明,anti-CEA scFv-Fc和anti-CA19-9 scFv-Fc的抗体浓度分别为8.2 nmol/L和6.0 nmol/L.结论 anti-CEA scFv和anti-CAl9-9 scFv能在HEK293细胞内表达;虽然表达量较低,但纯化后表达产物能够识别肿瘤细胞表面抗原CEA和CA19-9.
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长链非编码RNA FILNC1靶向调控c-Myc表达对肾细胞癌生物学行为的影响
目的 探讨长链非编码RNA FILNC1靶向c-Myc的表达调控肾细胞癌的生物学行为.方法 qPCR检测FILNC1在肾细胞癌组织和不同肾细胞癌细胞株中的表达情况;双荧光素酶报告基因检测FILNC1与c-Myc之间的相互作用;Western blot实验检测FILNC1对c-Myc蛋白的调控作用;MTT细胞增殖实验检测FILNC1和c-Myc对肾细胞癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测FILNC1和c-Myc对肾细胞癌细胞凋亡行为的影响;裸鼠成瘤实验检测FILNC1对肾细胞癌裸鼠移植瘤的影响.结果 与其他肾细胞癌细胞株相比,A498细胞中FILNC1的表达水平明显较高;双荧光素酶实验证实FILNC1可直接调控c-Myc的表达,抑制FILNC1和c-Myc的表达可以减弱肾细胞癌细胞的增殖能力,促进细胞的凋亡;抑制FILNC1的表达后肾细胞癌细胞在裸鼠体内异种移植能力受到一定的抑制.结论 FILNC1可以靶向调节c-Myc的表达影响肾细胞癌细胞的增殖与凋亡.
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NOTCH通路依赖PI3K/AKT通路调控胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力
目的 探讨NOTCH通路对胶质母细胞瘤细胞增殖和自我更新能力调控及其潜在机制.方法 体外培养LN-229、U118-MG和A172胶质瘤干细胞球;MTT实验和单细胞成球实验分别检测胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力;靶向AKT1慢病毒载体shRNA和PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K/AKT信号通路活性,检测NOTCH通路功能是否依赖PI3K/AKT通路;Westem blot检测NOTCH通路和PI3K/AKT通路活性;BLISS独立模型评价NOTCH抑制剂DAPT和LY294002的相互作用.结果 LN-229、U118-MG和A172体外培养形成胶质瘤干细胞球;DAPT抑制NOTCH通路活性同时降低PI3K/AKT通路活性,且NOTCH通路对PI3K/AKT通路的调控不依赖于PTEN介导;DAPT抑制胶质瘤干细胞增殖和体外单细胞成球能力;ShAKT1和LY294002抑制PI3K/AKT通路活性,同时显著减弱DAPT对胶质瘤干细胞增殖和体外单细胞成球能力的抑制作用(P＜0.05),DAPT和LY294002联合使用产生拮抗作用.结论 NOTCH通路依赖于PI3K/AKT通路调控胶质瘤干细胞增殖和自我更新能力.
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桔梗皂苷D对人移行细胞癌5637细胞株的诱导凋亡作用及其分子机制
目的 探讨桔梗皂苷D对人移行细胞癌5637细胞诱导凋亡作用及分子机制.方法 HE染色和透射电子显微镜观察细胞的形态学变化;流式细胞学技术检测细胞凋亡率的变化;Western blot法检测凋亡通路相关蛋白的表达变化;PCR法检测p53、Bcl-2、Bax mRNA表达;免疫组织化学法检测凋亡相关蛋白表达的影响.结果 通过HE染色和电子显微镜观察桔梗皂苷D组5637细胞,可见凋亡细胞,凋亡指数明显高于对照组(P＜0.01);与对照组细胞相比,桔梗皂苷D组5637细胞Survivin、Livin表达量明显下降(P＜0.05);Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、Cyt-c表达量与对照组比较,明显增加(P＜0.05);p53、Bax mRNA水平明显升高,Bcl-2mRNA表达下降(P.＜0.01);Bax、Caspase-9、Caspase-8以及Caspase-3表达较对照组增多,而Bcl-2表达则明显下降(P＜0.01).结论 桔梗皂苷D能诱导人移行细胞癌5637细胞凋亡,其作用机制可能与上调Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、Cyt-c、p53和下调Bcl-2表达、激活线粒体途径和死亡受体途径有关.
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Garcinone E抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的研究
目的 探讨源于岭南山竹的天然产物单体Garcinone E对鼻咽癌细胞增殖、迁移侵袭能力的影响及其分子机制.方法 MTS法检测鼻咽癌HONE1和HK1细胞的增殖率;Transwell细胞小室检测HONE1和HK1细胞迁移和侵袭的能力;Western blot和q-PCR法检测HONE1和HK1细胞上皮间充质转化(EMT)相关标志性蛋白和基因表达及可能的信号通路.结果 MTS 24 h结果显示Garcinone E可显著抑制鼻咽癌细胞HONE1和HK1的生长,并和浓度呈正相关作用.Transwell小室实验显示,与对照组相比,Garcinone E的给药浓度为7.5 μmol/L时,HONE1和HK1细胞穿过小室的数量明显减少,其迁移和侵袭能力明显受到抑制.Western blot检测发现Garcinone E呈剂量依赖性地下调p-Vimentin、Snail及Slug蛋白的表达,同时增加E-cadherin蛋白的表达.q-PCR表明Garcinone E呈剂量依赖性地上调两种鼻咽癌细胞中E-cadherin的mRNA表达.结论 Garcinone E能够有效抑制鼻咽癌细胞增殖并抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与抑制鼻咽癌细胞EMT的发生有关.
关键词： Garcinone E 鼻咽癌细胞 上皮间质转化 -
干扰CD151基因表达对裸鼠宣威肺腺癌XWLC-05细胞肺转移的影响
目的 探讨RNA干扰抑制CD151基因表达对宣威肺腺癌XWLC-05细胞侵袭和迁移的影响及裸鼠肺转移的实验.方法 构建能高效抑制CD151基因表达的3组重组干扰质粒,筛选出稳定转染干扰质粒的宣威肺腺癌XWLC-05细胞株.MTT、划痕实验、Transwell实验研究干扰CD151基因表达前后对细胞迁移和侵袭的影响.将构建的RNA干扰抑制CD151基因表达的稳转细胞XWLC-05-shRNA、XWLC-05-shNC、XWLC-05-Blank通过尾静脉注射入BALB/c裸鼠,30天后通过肉眼和HE染色后观察肺转移情况.结果 划痕实验和Transwell实验表明RNA干扰抑制CD151基因表达可能抑制宣威肺腺癌XWLC-05细胞体外迁移和侵袭作用(P＜0.05).XWLC-05-shRNA、XW LC-05-shNC、XWLC-05-Blank各组裸鼠肺转移率及肺组织上的转移病灶数依次为75％(6/8)与(5.2±1.2)、100％(8/8)与(9.8±1.6)、87.5％(7/8)与(9.1±1.2).XWLC-05-shNC与XWLC-05-Blank组比较差异无统计学意义(P=0.423),XWLC-05-shRNA与XWLC-05-shNC (P=0.000)和XWLC-05-Blank组比较差异有统计学意义(P=0.000).结论 RNA干扰抑制CD151基因表达能抑制XWLC-05细胞的体外迁移和侵袭;能减少XWLC-05细胞裸鼠的肺转移.CD151可能成为抑制宣威肺癌侵袭和迁移的潜在治疗靶点之一.
