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甲氨蝶呤可逆转PRPS1基因突变引起的急性淋巴细胞白血病细胞对6-巯基嘌呤的耐药性
目的:探讨甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)是否可以逆转磷酸核糖焦磷酸合成酶1 (phosphoribosyl pyrophosphate synthetasc 1,PRPS1)基因突变引起的急性淋巴细胞白血病细胞对6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)的耐药性,并初步探讨其可能的作用机制.方法:将携带野生型(wide type,WT) PRPS1基因以及A190T或S103T突变型PRPS1基因的重组慢病毒分别感染人急性淋巴细胞白血病Reh细胞(以感染空载体GV303作为空白对照),采用细胞活力实验和蛋白质印迹法验证上述细胞系构建成功.分别用MTX和6-MP单药以及MTX+6-MP联合用药处理各细胞系,然后锥虫蓝拒染法和Annexin V/7-AAD双染法分别检测细胞的增殖和凋亡情况;蛋白质印迹法检测DNA损伤相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平;细胞活力实验和液相色谱-质谱联用法分别检测MTX作用各细胞系后,6-MP对细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)、6-MP代谢产物以及次黄嘌呤水平的改变.结果:外源性PRPS1蛋白在Reh细胞中成功过表达,而且与对照组GV303和WT细胞系相比,感染PRPS1突变基因的A190T和S103T细胞系均对6-MP和MTX耐药,差异均具有统计学意义(P值均＜0.001).与MTX和6-MP单药组相比,MTX+6-MP联合用药可以更有效地抑制A190T和S103T细胞的增殖(P值均＜0.001),促进细胞凋亡(P＜0.01,P＜0.001),上调磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX,γH2AX)、磷酸化细胞周期检验点激酶2 (phosphorylated checkpoint kinase 2,p Chk2)及聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase,PARP]剪切体的表达(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001).此外,MTX处理各细胞后,6-MP对A190T和S103T细胞的IC50值远远低于MTX未处理组(P值均＜0.001),且细胞中次黄嘌呤的水平明显降低(P值均＜0.001),而6-MP的代谢产物硫代次黄嘌呤核苷酸(thioinosine monophosphate,TIMP)和硫代鸟嘌呤核苷酸(thioguanosine monophosphate,TGMP)的水平均明显升高(P值均＜0.001).结论:MTX可以逆转PRPS1基因突变引起的急性淋巴细胞白血病细胞对6-MP的耐药性,其机制可能与其抑制次黄嘌呤的异常积累有关.
