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非损伤微测技术实时检测海马脑片跨膜钙离子流
脑内β-淀粉样蛋白(amyloid-β protein,Aβ)的聚集是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的重要病理特征.Aβ的神经毒性作用机制与其扰乱神经元Ca2+稳态有密切关系.非损伤微测技术(non-invasive micro-test technique,NMT)是近年发展起来的一种利用Fick第一扩散定律和Nernst方程,通过非接触方式检测膜外扩散电位获取离子跨膜流速的新技术手段.本研究在C57BL/6小鼠海马脑片,利用NMT首次检测了Aβ对谷氨酸(Glu)诱发的Ca2+内流以及细胞外低钙引起的Ca2+外排的影响,并初步探讨了Aβ扰乱神经元Ca2+稳态的相关机制.结果显示:(1)急性给予Glu可诱发海马脑片CA1区神经元产生起始快、继而缓慢衰减的持续性内向Ca2+流;(2) Aβ预处理浓度依赖性地增强海马神经元对Glu的反应性,显著提高给药后5 min内Ca2+内流的平均流速,而NMDA受体拮抗剂D-APV可有效阻断Aβ对神经元Glu反应的这种易化作用;(3)用低钙人工脑脊液急性灌流脑片可引起海马CA1区神经元产生持续的外向跨膜Ca2+流,其大部分可被特异性Na+/Ca2+交换体抑制剂KB-R7943所阻断;(4)Aβ预处理可部分抑制低钙人工脑脊液引起的Ca2+外排.这些结果表明:Aβ引起的细胞内Ca2+超载不仅涉及到Ca2+内流增加,也与其对Ca2+外排的抑制有关;Aβ易化Glu的兴奋毒作用主要是通过NMDA受体介导的,其抑制Ca2+外排的靶点主要是Na+/Ca2+交换体.NMT具有操作相对简单、实时获取结果、非损伤的优点,适用于脑片Ca2+内流和Ca2+外排的长时间测定.因此,本研究不仅为解释Aβ所致Ca2+超载的神经毒性机制提供了新的实验证据,也为开展跨膜Ca2+信号转导机制的脑研究提供了新的技术方法.
