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阳离子化金针菇多糖的制备及其在大鼠胚胎成纤维细胞中的基因转染效率评价
目的: 以乙二胺对金针菇多糖(Flammulina velutipes polysaccharide,FVP)进行阳离子化修饰,构建新型非病毒基因载体,考察其与SOX2质粒(pSOX2)的结合能力,评价其在大鼠胚胎成纤维(rat embryonic fibroblast,REF)细胞中的转染效率.方法: 依次采用水提醇沉、纤维素柱和凝胶柱等方法分离、纯化FVP,然后,以N,N-羰基二咪唑为连接剂,通过化学修饰的方法将乙二胺键合到FVP骨架,制备得到乙二胺修饰的FVP(FVP-乙二胺).用红外、核磁、元素分析和Zeta电位测定等方法对FVP-乙二胺进行表征;用凝胶电泳阻滞实验考察FVP-乙二胺与pSOX2的结合能力;用动态光散射和Zeta电位仪测定FVP-乙二胺/pSOX2纳米粒的粒径和Zeta电位,并经透射电镜(TEM)观察纳米粒的形态.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法考察纳米粒对REF细胞的毒性,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)和实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)评价纳米粒对REF细胞的转染效率.结果: 成功制备得到FVP-乙二胺;凝胶电泳结果显示,FVP-乙二胺与pSOX2的质量比为10∶1时,能完全将质粒滞留于原孔;质量比为20∶1时,FVP-乙二胺/pSOX2纳米粒粒径小,呈分布均匀、大小均一的类球型.与阳性对照支化聚乙烯亚胺(PEI)/pSOX2和脂质体2000相比,FVP-乙二胺/pSOX2纳米粒对REF细胞的毒性明显降低,而转染效率显著提高.结论: 天然来源的FVP,加以适当的阳离子化修饰,可以被开发成一种安全、经济、高效的非病毒基因载体,为基因治疗和组织工程的基础研究奠定实验基础.
