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携带人尾型同源盒基因-2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定
目的 构建尾型同源盒基因-2(CDX2)基因的慢病毒表达载体并进行鉴定.方法 PCR扩增CDX2基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pWPI,通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒.重组质粒转染包装细胞293T后获得包装的病毒颗粒.病毒颗粒感染直肠癌细胞XB 1847,经PCR和Western Blot证明重组慢病毒携带的CDX2在XB1847细胞内表达的情况.结果 经PCR扩增、酶切及测序验证,重组质粒构建成功,命名为pWPI-CDX2.PCR和Western Blot证明重组慢病毒感染XB 1847细胞后CDX2能稳定表达.结论 成功构建了携带CDX2的慢病毒载体,为研究CDX2在直肠癌中的功能提供了实验基础.
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尾型同源盒基因2沉默对人胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP多药耐药性的逆转
目的 探讨尾型同源盒基因2(Cdx2)沉默对逆转人胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP多药耐药性的影响.方法 将对数生长期的人胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP接种于培养板中,分为3组:感染RNA干扰Cdx2基因沉默重组慢病毒载体(pLL-Cdx2-shRNA)作为实验组；感染慢病毒空载体作为阴性对照组；空白对照组不做任何处理.Western blot及RT-PCR检测Cdx2及凋亡相关基因c-myc、cyclin D1、survivin等蛋白及mRNA表达水平；MTT法检测3组细胞对化疗药物阿霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂的敏感性；流式细胞技术检测3组细胞阿霉素的泵出率、细胞周期分布及细胞凋亡情况.计量资料用x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用SNK-q检验,计数资料采用x2检验.结果 实验组、阴性对照组、空白对照组人胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP中各蛋白相对表达量:Cdx2分别为0.187 ±0.060、0.535±0.033、0.567±0.014,c-myc分别为0.086±0.004、0.379±0.006、0.354±0.004,cyclin D1分别为0.016±0.005、0.141±0.003、0.162 ±0.008,survivin分别为0.276±0.012、0.672±0.009、0.517±0.313,与阴性对照组和空白对照组比较,实验组上述蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义(F =247.385,3.353,597.882,98.628,P＜0.05).实验组、阴性对照组、空白对照组mRNA相对表达量:Cdx2分别为0.184±0.010、0.894±0.056、0.837±0.049,c-myc分别为0.212±0.022、0.538±0.021、0.545±0.032,cyclin D1分别为0.045±0.009、0.163±0.009、0.157 ±0.010,survivin分别为0.401±0.027、0.824±0.016、0.782±0.056,与阴性对照组和空白对照组比较,实验组上述基因mRNA表达量明显下降,差异有统计学意义(F=243.776,161.793,138.523,118.426,P＜0.05).MTT法检测实验组、阴性对照组和空白对照组人胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP阿霉素IC50值分别为(0.12±0.05)mg/L、(0.33±0.08)mg/L、(0.39±0.15) mg/L,5-氟尿嘧啶IC50值分别为(0.52±0.13) mg/L、(4.10±1.25) mg/L、(4.05±1.44) mg/L,顺铂IC50值分别为(0.82±0.13) mg/L、(2.81 ±0.50) mg/L、(3.28±1.03) mg/L.实验组、阴性对照组、空白对照组中人胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP对阿霉素泵出率分别为0.21％、0.37％和0.35％.与阴性对照组和空白对照组比较,实验组人胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP对阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50值及对阿霉素的泵出率显著降低,差异均有统计学意义(F=8.101,13.854,15.159,x2=7.106,P＜0.05).实验组、阴性对照组与空白对照组人胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP G0/G1期细胞比例分别为17.87％、34.71％、37.20％,与阴性对照组和空白对照组比较,实验组G0/G1期细胞减少,差异有统计学意义(x2=1.055,P＜0.05)；实验组G2/M期的细胞比例为11.93％,细胞凋亡率为31.13％,均明显高于阴性对照组的0.26％、16.58％和空白对照组的0.35％、13.18％,差异有统计学意义(x2=2.249,11.030,P＜0.05).结论 Cdx2基因沉默可有效提高人胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP对化疗药物的敏感性,增加化疗药物在胃癌细胞内的蓄积浓度,逆转人胃癌耐顺铂细胞SGC7901/DDP的耐药性.
关键词： 胃肿瘤 尾型同源盒基因-2 胃癌耐顺铂SGC7901细胞 多药耐药性
