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隐性先天性高铁血红蛋白血症文献资料
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RNA干扰法建立人NADH-细胞色素b5还原酶缺陷的细胞表型
目的 探索经载体介导的RNA干扰法建立人NADH-细胞色素b5还原酶(EC1.6.2.2,NADH-cytochrome b5 reductase,b5R)缺陷细胞系的可行性.方法 设计并构建b5R的两种小干扰RNA(small inter-ference RNA,siRNA)表达载体,脂质体转染法瞬时转染BEL-7402细胞,半定量逆转录-PCR分析重组载体的干扰效应;G418筛选两种表达载体稳定转染的BEL-7402细胞,并通过稳定转染的细胞克隆在b5R mRNA水平,酶活性,酶含量等方面干扰效果的鉴定,获得b5R缺陷的细胞克隆;噻唑蓝法测定b5R缺陷细胞的生长曲线.结果 获得两个靶向b5R基因的siRNA重组表达载体pSib5R-1和pSib5R-2,其中pSib5R-2瞬时转染对BEL-7402细胞b5R mRNA的抑制率达68.3%.获得18个稳定转染的细胞克隆,pSib5R-2转染的克隆中有两个克隆MR mRNA抑制率达48.2%和56.2%,酶活性抑制率为54.6%和63.5%,酶含量也有明显降低.b5R酶缺陷没有改变细胞的生长速度.结论 b5R基因的表达可被载体介导的RNA干扰有效抑制,成功建立了b5R缺陷的细胞表型,为进一步研究b5R基因的功能以及探讨Ⅱ型隐性先天性高缺血红蛋白症的发生机制提供了实验依据和材料.
