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粪肠球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立用于检测粪肠球菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法.方法 根据粪肠球菌的d-丙氨酸聚连接酶(ddl)基因设计TaqMan FQPCR的引物及探针,并使用39种常见致病菌和条件致病菌检测其特异性.将目的基因克隆到质粒中,制作标准曲线,确定方法的检测下限.制备血液模拟标本,直接提取核酸进行检测,探索临床应用的可能.结果 在特异性评价实验中,除阳性对照外其余样本均未出现特异性扩增曲线.建立粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法的标准曲线,确定该方法的检测下限为20 copy/管.通过对粪肠球菌血液模拟标本的检测发现,本方法对模拟标本的检测灵敏度为3.9×103cfu/ml.在稳定性评价中,对含菌量为3.9×108、3.9×106和3.9×104cfu/ml的血液模拟标本重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数(CV)为0.99％ ～ 1.84％.结论 本研究建立了适用于临床标本检测的粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法.
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弗氏枸橼酸杆菌TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法的建立
目的 建立针对弗氏枸橼酸杆菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real time-PCR)检测方法.方法 针对弗氏枸橼酸杆菌的特有序列设计引物和TaqMan探针,扩增目的基因建立标准曲线,确定检测方法的灵敏度；对20种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌进行检测,评价该检测方法的特异性；使用牛奶模拟标本评价方法在实际检测工作中应用性.结果 TaqMan real time-PCR检测方法对弗氏枸橼酸杆菌重组质粒的检测灵敏度为1.0×101拷贝/反应体系；该检测方法在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增.该检测方法对牛奶模拟样本中弗氏枸橼酸杆菌检测下限为1.0×102cfu/ml的菌量；通过对1.0×107、1.0×105和1.0×103三个浓度质粒标准品的重复检测,确定本方法的组内变异系数为1.90％～3.91％；组间变异系数为1.52％ ～ 1.69％.结论 本研究建立的TaqMan real time-PCR检测方法可作为检测弗氏枸橼酸杆菌灵敏、特异、快速的方法.
