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弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定
本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2 (ROP2),并初步评价其免疫反应性.主要步骤为体外细胞培养速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP2基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM (DE3) pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His-ROP2,后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性.本研究获得了ROP2全长重组蛋白,初步证明其良好的免疫反应性,为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法,研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础.
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重组人Leptin对小鼠胃肠运动的影响
目的:观察重组人Leptin(rh-leptin)对小鼠胃肠推进运动的影响,并且探讨其作用机制.方法:经大肠杆菌重组表达并纯化获得rh-leptin.12只Km小鼠随机分为两组:rh-leptin组(n=6,腹腔注射rh-leptin 2.5 mg/kg)和对照组(n=6,腹腔注射生理盐水12.5 ml/kg),给药3 h后以5%的炭末阿拉伯胶混悬液灌胃,15 min后处死小鼠,比较两组小鼠炭末移动距离占小肠全长的百分率即小肠推进率,以观察rh-leptin对胃肠运动的影响.结果:对照组小肠推进率为(54.53±11.08)%,rh-leptin组小鼠肠推进率为(41.98±5.81)%,rh-leptin组小鼠小肠推进率显著降低(P＜0.05).结论:rh-leptin能降低小鼠胃肠蠕动速率,抑制其胃肠推进运动.
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梅毒螺旋体TpN15抗原重组表达及rTpN15-ELISA血清学检测效果
目的:克隆并构建梅毒螺旋体tpN15基因原核表达系统,建立基于rTpN15的ELISA并对其用于梅毒血清学诊断的敏感性和特异性进行评价.方法:采用PCR扩增tpN15基因,构建tpN15基因原核表达系统.采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rTpN15表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rTpN15,Western blot鉴定rTpN15的免疫反应性.以rT-pN15为包被抗原,建立rTpN15-ELISA并用于检测138例梅毒病人血清,其检测结果与RPR和TPHA进行比较.结果:克隆的tpn15基因与GenBank中相关序列相似性为100%.rTpN15表达量为细菌总蛋白的23.4%.提纯的rTpN15在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带.TPHA阳性的梅毒病人血清能有效识别rTpN15并与之结合.rTpN15-ELISA对梅毒病人血清标本检测阳性率为96.4%(133/138),与TPHA检测阳性率(97.8%,135/138)相近(P>0.05),rTpN15-ELISA和TPHA检测阳性率均显著高于TRUST(82.6%,114/138)(P<0.01).结论:本研究中成功地克隆并构建了梅毒螺旋体tpN15基因及其原核表达系统.以rTpN15为包被抗原的的rTpN15-ELISA可作为快速、简便、敏感和特异的梅毒血清学筛查方法.
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弓形虫分泌蛋白ROP5的全基因原核重组表达与抗原性鉴定
目的 在大肠杆菌工程菌中重组表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白5(ROP5)的融合蛋白GST-6×His-ROP5,并初步评价重组蛋白的抗原性.方法 体外细胞培养弓形虫速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP5基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM (DE3) pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,后通过Western blotting鉴定重组蛋白rROP5的抗原性.结果 构建了弓形虫ROP5全基因重组表达质粒,诱导表达了GST-6×His-ROP5融合蛋白,分子量为96 kDa,与预测结果相符,重组蛋白与人源抗血清有显著免疫印迹反应.结论 本研究获得了弓形虫ROP5全长重组蛋白,为进一步改进弓形虫诊断抗原,研究蛋白结构以及分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础.
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弓形虫致密颗粒蛋白GRA7的全基因原核重组表达
目的 克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)的全长基因,在大肠杆菌工程菌中重组表达GST-His-GRA7融合蛋白.方法 提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA7基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM (DE3) pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,后采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白产物.结果 构建了弓形虫GRA7全基因的重组表达质粒,诱导表达了GST-His-GRA7融合重组蛋白,分子量为62kD,与预测结果相符.结论 研究获得了弓形虫GRA7全基因的重组蛋白,为进一步研究弓形虫GRA7抗原性及其与宿主细胞的相互作用奠定了基础.
关键词： 刚地弓形虫 致密颗粒蛋白GRA7 反转录基因克隆 原核重组表达
