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癌胚抗原启动子控制基因靶向表达研究
目的 构建由癌胚抗原(CEA)启动子控制报道基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的重组表达质粒CMVE-pCEA-IRES-EGFP.了解CEA启动子靶向驱动的含目的基因的重组质粒的效率.方法 构建重组质粒CMVE-pCEA-IRES-EGFP,以PCR,DNA测序及酶切进行鉴定.通过脂质体介导重组质粒CMVE-pCEA-IRES-EGFP体外分别转染A549细胞(CEA阳性)和16HBE(CEA阴性)细胞,进行绿色荧光蛋白检测分析基因表达的靶向性.结果 CMVE-pCEA-IRES-EGFP分别用VSP Ⅰ,VSP Ⅰ/Nhe Ⅰ酶切后电泳分别出现大小约405 bp,372 bp和4110 bp的片断,与预计各片断大小相符.以CMVE-pCEA-IRES-EGFP为模板PCR扩增得到CMV和CEA片段,分别连于T载体(pMD18-T)并测序,结果正确.嵌合启动子CMVE-pCEA能特异地驱动下游报告基因在CEA阳性肺癌细胞株绿色荧光表达阳性,而CEA阴性细胞株16HBE表达阴性.结论 成功构建了嵌合启动子CMVE-pCEA驱动的CMVE-pCEA-IRES-EGFP重组质粒,并能在转染的CEA阳性细胞株中表达,为靶向启动双基因表达载体构件提供了实验依据.
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5HRE联合CEAp靶向调控RASSF1A基因对SGC7901胃癌细胞株抑制作用的研究
目的 探讨人5拷贝低氧反应元件(5HRE)联合癌胚抗原启动子(CEAp)调控元件的靶向性及调控RAS相关区域家族1A (RASSF1A)抑癌基因的慢病毒载体对SGC7901胃癌细胞的抑制作用.方法 ①分别采用实时定量RT-PCR (qRT-PCR)、免疫组织化学SP染色及Western blot法检测SGC7901、MKN28和MCF-10A细胞株中癌胚抗原(CEA)mRNA及其蛋白,以及RASSF1A蛋白的表达水平,以确定实验细胞和阴性对照细胞.②构建pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体以转染SGC7901、MKN28和MCF-10A细胞株,将各细胞株分为2组,分别加入(缺氧组)或不加入CoCl2(常氧组),比较各细胞株中缺氧组和常氧组细胞的启动活性.③将重组慢病毒载体(pLV-5HRE-CEAp-RASSF 1A)及相应空病毒载体包装成病毒颗粒LV-5HC-RASSF 1A(感染组)和LV-NC(阴性对照组),感染SGC7901细胞.以未感染任何病毒的SGC7901细胞作为空白对照组,将该3组细胞再分为2个亚组,分别加入(缺氧组)或不加入CoCl2(常氧组),比较缺氧组和常氧组细胞中RASSF1A蛋白的表达水平和细胞增殖抑制率.结果 ①qRT-PCR结果显示:SGC7901细胞株中CEA mRNA的表达水平高于MKN28及MCF-10A细胞株(P＜0.05);免疫组织化学染色结果显示:CEA的表达水平在SGC7901、MKN28及MCF-10A细胞株中依次递减,两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05);Western blot结果显示:在SGC7901及MKN28细胞株中未检测到RASSF1A蛋白的电泳条带,而在MCF-10A细胞株中可检测到.据此确定SGC7901细胞株为实验细胞,MKN28细胞株为阴性对照细胞.②转染pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体后,在SGC7901及MKN28细胞株中,同种细胞株内与常氧组比较,缺氧组细胞的活性倍数均升高(P＜0.01);而在MCF-10A细胞株中,常氧组和缺氧组细胞的活性倍数比较差异无统计学意义(P＞0.05).在不加入CoCl2条件和加入CoCl2条件下,同等条件下与SGC7901细胞株比较,MKN28及MCF-10A细胞株的活性倍数均较低(P＜0.05);与MKN28细胞株比较,MCF-10A细胞株的活性倍数较低(P＜0.05).③细胞感染病毒后的Western blot检测结果显示:在SGC7901细胞,空白对照组及阴性对照组细胞在常氧和缺氧条件下其RASSF1A蛋白均呈弱表达,差异不明显;感染组细胞在常氧条件下RASSF1A蛋白呈弱表达,而在缺氧条件下RASSF1A蛋白的表达水平明显增加.在MKN28细胞,空白对照组、阴性对照组及感染组细胞在常氧及缺氧条件下均未见电泳条带.细胞活性检测实验结果显示:在SGC7901细胞,与感染-缺氧组比较,其余5组细胞的生长抑制率均较低(P＜0.05);在MKN28细胞,与空白对照-常氧组和空白对照-缺氧组细胞比较,其余4组细胞的生长抑制率均较高(P＜0.05),但该4组细胞间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 5HRECEAp调控元件具有低氧诱导及靶向CEA转录阳性胃癌细胞的双调控能力;RASSF1A慢病毒载体(pLV-5HRECEAp-RASSF1A)在低氧诱导下具有抑制SGC7901胃癌细胞株增殖的能力.
关键词： 5拷贝低氧反应元件 癌胚抗原启动子 Ras相关区域家族1A基因 胃癌 基因治疗 -
慢病毒介导5HRE－CEAp调控RASSF1A表达对胃癌细胞SGC7901抑制的研究
目的:探讨5拷贝低氧反应元件(5HRE)联合癌胚抗原启动子(CEAp)调控抑癌基因RAS相关域家族1A(RASSF1A)的慢病毒载体(LV－5HRE－CEAp－RASSF1A)对胃癌细胞SGC7901的体外抑制作用.方法:采用qRT－PCR方法检测空白对照组细胞SGC7901、阴性对照组细胞SGC7901/NC及慢病毒载体感染的实验组细胞SGC7901/5HRE－CEAp－RASSF1A中RASSF1A mRNA表达水平;通过CCK－8实验检测各组细胞的生长曲线;通过流式细胞技术检测各细胞的凋亡及细胞周期.结果:qRT－PCR结果显示,与其他组比较,实验组细胞的RASSF1A mRNA水平在低氧条件下明显升高(P＜0.01);CCK－8实验结果显示从第3天开始,低氧条件下实验组细胞的OD值开始低于其它各组细胞(P＜0.05);流式细胞检测结果显示与其它各组细胞比较,低氧条件下实验组细胞凋亡比例明显增加(P＜0.01),并且其细胞周期G1期的细胞百分比明显增加(P＜0.05).结论:慢病毒载体LV－5HRE－CEAp－RASSF1A具有在低氧诱导下显著抑制胃癌细胞株SGC7901增殖的作用.
关键词： 5拷贝低氧反应元件 癌胚抗原启动子 RAS相关域家族1A基因 胃癌 基因治疗
