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应用CS-SELEX技术筛选特异性结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B适配子的研究
目的 应用CS-SELEX(cell surface-system evolution of ligands by exponential enrichment)技术筛选与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)非结构蛋白4B(non protein 4B,NS4B)特异性结合的ssDNA适配子,建立检测HCV NS4B的酶联寡聚核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)方法.方法 构建pDisplay-NS4B质粒,并转染至HepG2细胞中,在G418存在情况下连续筛选1个月,得到单克隆细胞群,经过Western blot以及流式细胞术验证,获得稳定表达NS4B的HepG2细胞.设计并合成随机序列ssDNA文库,以稳定表达NS4B的细胞为正向筛选靶细胞,以HepG2细胞为反筛细胞进行CS-SELEX技术筛选.每轮筛选获得的具有结合NS4B能力的ssDNA适配子,通过PCR扩增得到富集,随后通过不对称PCR获得下一轮筛选的ssDNA文库.经过16轮筛选,将亲和力高的筛选产物克隆并测序,用ELONA方法检测适配子的亲和力.结果 成功构建表面展示表达重组质粒pDisplay-NS4B.分别将该质粒转入HepG2细胞,通过G418筛选获得稳定表达HCV-NS4B的细胞系NS4B-HepG2.对CS-SELEX筛选的各轮适配子库进行亲和力测定,其中第14轮库适配子与NS4B的亲合力高.分别对第14轮库中的单个适配子进行亲和力测定,以适配子ZN1和ZN5与NS4B的亲合力高.ZN1和ZN5不仅能结合展示在细胞表面的NS4B蛋白,还能结合丙型肝炎病毒感染细胞(HCV cell culture,HCVcc)中的HCV-NS4B蛋白.结论 适配子ZN1和ZN5对NS4B有高亲和力,这对研究HCV-NS4B致癌机制、HCV诊断以及治疗方面有潜在的应用价值.
关键词： 丙型肝炎病毒(HCV) 非结构蛋白-NS4B CS-SELEX 适配子
