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功能性纳米羟基磷灰石的生物相容性及安全性评价
采用水热合成法制备的铽离子掺杂的精氨酸修饰的纳米羟基磷灰石颗粒(HAP/Arg),对HAP/Arg的生物安全性进行体内外研究,探讨其作为基因治疗药物载体的可行性.选择人正常血管内皮细胞(HAEC)以及人肿瘤细胞株(Hela细胞)作为体外细胞模型,用酶标免疫检测仪检测其在0、25、50～200 μg/mL HAP/Arg纳米颗粒影响下的细胞存活率,用LDH法检测其在不同浓度的HAP/Arg纳米颗粒影响下的细胞膜的结构完整性.选择健康小鼠作为动物模型,将其分为低剂量组(10 μg/mL/20 g体重)、中剂量组(100 μg/mL/20 g体重)、高剂量组(500μg/mL/20 g体重)及对照组,进行死亡计数、血清生化指标检测以及倒置荧光显微镜观察主要脏器的病理学特征.根据急性毒性实验结果,将健康小鼠分为低剂量组(0.09 mg/(kg·d))、中剂量组(4.5 mg/(kg·d))、高剂量组(225 mg/(kg·d))及对照组,按照新药临床前安全性评价标准判断其生殖毒性.结果表明:0、25、50 ～ 200 μg/mL的HAP/Arg纳米颗粒在4、24、48、72 h不同时间下对所选择的HAEC细胞和Hela细胞的正常生长和细胞膜结构均无明显影响.在动物的急性毒性实验和生殖毒性实验中,HAP/Arg各剂量组及对照组小白鼠均未出现明显的毒性反应及死亡情况,病理切片也均未见主要脏器结构有炎症及损伤性变化.统计学分析表明,HAP/Arg各剂量组与对照组相比均无显著差异(P＞0.05).这些结果为下一步构建一种高效、安全、简便的新型纳米基因转导系统打下基础.
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功能性纳米羟基磷灰石与细胞相互作用及其机制
目的:选取自备的铽掺杂的精氨酸表面修饰的羟基磷灰石(arginine functionalized hydroxyapatite,HAP/Arg)纳米颗粒,研究该纳米颗粒与细胞的相互作用及血管内皮细胞对HAP/ Arg纳米颗粒的内吞动力学和内吞入胞的相关机制.方法:选取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)作为研究模型细胞,利用激光扫描共聚焦显微镜观察HAP/Arg纳米颗粒的细胞摄取,利用细胞流式仪及原子力显微镜测定不同浓度下细胞摄取后的平均荧光强度.结果:铽掺杂的HAP/Arg纳米颗粒被HUVECs摄取后主要存在于细胞质中,而且大部分分布在细胞核区域周围.HAP/Arg纳米颗粒的入胞过程具有时间和浓度依赖性,作用时间以4h为宜,纳米颗粒的浓度以50 mg/L为佳.精氨酸修饰的HAP纳米颗粒人胞量明显强于未经精氨酸修饰的HAP纳米颗粒.结论:HAP/Arg纳米颗粒进入HUVECs是一个主动转运的能量依赖的过程,以网格蛋白和小凹蛋白介导的内吞相结合的细胞跨膜转运机制,但以小凹蛋白介导内吞途径为主.
