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6A8 α-甘露糖苷酶也表达于细胞膜
目的制备6A8 α-甘露糖苷酶羧基端单抗并进行鉴定，以确定6A8 α-甘露糖苷酶在细胞的表达部位。方法用基因重组技术构建6A8 cDNA 3′端DNA片段的重组表达载体，在原核细胞表达其编码蛋白，杂交瘤技术制备单抗，以3D5细胞为靶细胞，间接免疫荧光染色后，用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪鉴定单抗。结果 6A8 cDNA 3′端DNA在原核细胞获得表达，制备了抗6A8 α-甘露糖苷酶羧基端的单抗，观察到6A8 α-甘露糖苷酶不仅表达于3D5细胞胞浆，也表达于胞膜。结论成功地制备了抗6A8 α-甘露糖苷酶羧基端单抗，6A8 α-甘露糖苷酶不仅表达于3D5细胞胞浆中，也表达于胞膜。
关键词： 6A8 α-甘露糖苷酶 单克隆抗体6A8a 细胞膜 -
BJAB细胞在转导6A8 α-甘露糖苷酶的反义DNA后发生oncosis样死亡
目的采用形态学和分子生物学方法,分析转导6A8 α-甘露糖苷酶的反义DNA导致的B细胞株BJAB死亡的性质. 方法用Giemsa染色、annexin-Ⅴ荧光染色、梯形DNA电泳以及透射电子显微镜等方法,分析细胞死亡的性质;应用Con A结合试验,检测转基因细胞6A8 α-甘露糖苷酶活性的改变;应用Fluo-3探针测定细胞胞浆[Ca2+]i. 结果用重组腺相关病毒(rAAV)颗粒成功地将反义6A8 DNA转导入了EB病毒转化的B细胞株BJAB.在克隆中,转导反义6A8 DNA的BJAB细胞在生长到3～10个细胞时死亡,而野生型、转导空载或转导正义6A8 DNA的BJAB细胞生长良好.转导反义6A8 DNA的BJAB细胞呈聚集状生长,且有大量细胞肿胀,终死亡.Giemsa染色光镜观察、annexin-Ⅴ荧光染色、梯形DNA电泳及透射电镜观察结果表明,这种死亡是一种oncosis(肿胀死)样死亡.Con A结合试验表明,BJAB细胞在转导反义6A8 DNA后的结合率升高,而转导正义6A8 DNA后的结合率则下降.另外,转导反义6A8 DNA的细胞胞浆[Ca2+]i升高. 结论转导反义6A8 DNA引起BJAB细胞发生oncosis样死亡,这种死亡可能与6A8 α-甘露糖苷酶表达被抑制有关.
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CD54和LFA-1的相互作用在6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的JurkatT细胞的黏附性增强中的作用
目的研究CD54和LFA-1的相互作用在6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的Jurkat 细胞(AS)的黏附性增强中的作用. 方法用细胞凝集试验确证AS细胞间黏附的增强,用细胞与细胞间黏附分子-1-人IgG的Fc片段(ICAM-1-Fc)的黏附试验和阻断性抗CD11a抗体的阻断试验研究CD54-LFA-1的作用,用单克隆抗体MEM-148检测AS细胞LFA-1亲和力的变化,用单克隆抗体NKI-L16检测AS细胞LFA-1亲合力的变化,用鬼笔环肽染色细胞骨架,用Jurkat-Raji细胞间的作用作模型研究6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制对T和B细胞间黏附的影响,用Con A结合试验检测细胞中蛋白质N-糖基化的变化. 结果 (1)AS细胞间的黏附性增强主要与CD54及CD11a表达的增强相关,也与LFA-1亲和力的增高相关;(2)AS细胞的细胞骨架发生重排;(3)AS细胞与Raji细胞间的黏附也增强;(4)Con A与AS细胞的结合增强. 结论 CD54和LFA-1的相互作用在AS Jurkat T细胞的黏附性增强中起重要作用.细胞骨架重排也可能起作用.AS细胞的蛋白质发生了N-糖基化修饰.
关键词： 6A8 α-甘露糖苷酶 CD54 LFA-1 细胞骨架 Con A
