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核因子-1B文献资料
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TRAF6shRNA对LPS/TLR4信号传导通路的体外干预作用
目的:体外研究shRNA(short hairpin RNA)沉默基因TRAF6的表达对RAW264.7细胞增殖的影响,初步探讨TRAF6-shRNA对LPS/TLR4胞内信号转导的影响.方法:构建靶向抑制小鼠TRAF6的shRNA的真核表达载体,转染RAW264.7细胞后培养48h,予以终浓度为100 ng/mL的LPS刺激,0、4、8h和16h后收集细胞上清,同时设空白对照及地塞米松阳性对照组,ELISA法测定上清液中TNF-α、IL-lβ、TGF-β1,Real-timePCR方法检测TRAF6、IL-6、COX-2 mRNA,Western blot检测细胞核内NF-κB p65.结果:转染TRAF6-shRNA 48 h后,TRAF6mRNA及蛋白表达明显受到抑制,其抑制率分别为79.17%、68.74%.MTT法检测结果显示,重组质粒转染72 h内对细胞增殖无明显的抑制.LPS刺激后,TNF-0、IL-1β、TGF-β1表达量都有明显变化(P＜0.01),其中TNF-α、IL-1β在8h达高峰,TGF-β1在16h达高峰,TRAF6基因沉默后,以上细胞因子增长率明都显下降(P＜0.01).实验结果显示,TRAF6基因沉默明显能下调IL-6、COX-2 mRNA表达,并能抑制LPS激活的NF-κB核转位.结论:重组质粒TRAF6-shRNA能有效降低RAW264.7细胞中基因TRAF6 mRNA及蛋白的表达,并对内毒素炎症反应具有明显的抑制效应.
