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亚甲蓝对大鼠椎间盘纤维环细胞增殖及凋亡的影响
目的:探讨不同浓度亚甲蓝对大鼠椎间盘纤维环细胞增殖及凋亡的影响.方法:取3月龄清洁级SD大鼠尾椎椎间盘纤维环,采用胶原酶及胰酶序贯消化法获得纤维环细胞并进行体外扩增培养,镜下观察细胞生长情况.将第3代纤维环细胞分为对照组(不施加亚甲蓝干预)及不同浓度亚甲蓝干预组,分别为低浓度组(2μg/ml)、中浓度组(20μg/ml)及高浓度组(200μg/ml),干预后2h、4h、6h、12h、24h及72h通过CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 (easpase-3)试剂盒检测caspase-3活性,RT-PCR及Western Blot检测I型胶原、转化生长因子β1(TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)、caspase-3、凋亡调节蛋白bcl-xl及bax的mRNA及蛋白表达.结果:原代纤维环细胞早期可形成细胞集落并向四周克隆生长,速度较慢,14d后达到80％～90％融合.传代后细胞生长速度明显加快,细胞多呈梭形,并有伪足伸出.亚甲蓝干预后可以显著抑制纤维环细胞增殖,促进纤维环细胞凋亡,中、高浓度组细胞凋亡率分别为74.95％及90.09％,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);且随亚甲蓝浓度增加,抑制细胞增殖及促进细胞凋亡作用越明显,不同浓度组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05);RT-PCR及Western Blot结果显示,亚甲蓝干预后Ⅰ型胶原、TGF-β1、bFGF、TIMP-1及bcl-xl表达显著降低,而caspase-3及bax表达升高,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);且随亚甲蓝浓度增加,抑制作用越明显,不同浓度组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:亚甲蓝以浓度依赖性方式抑制纤维环细胞增殖及促进细胞凋亡,其促进细胞凋亡的机制可能与bcl-xl/bax途径有关;同时亚甲蓝以浓度依赖性方式抑制纤维环细胞分泌细胞外基质,其机制可能与TIMP-1促进细胞外基质降解有关.
