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ANXA11表达稳定下调小鼠肝癌Hca-F细胞株的构建
目的:构建膜联蛋白A11 (annexin A11,ANXA11)稳定下调的小鼠肝癌高淋巴转移力细胞株Hca-F.方法:合成2条针对ANXA11的发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)序列shRNA1和shRNA2,连接到pGPU6/GFP/Neo质粒中,并转染到Hca-F细胞,获得了稳定转染的pGPU6/GFP/Neo-ANXA11-Hca-F细胞株.通过有限稀释法筛选单克隆细胞,并利用RT-PCR和蛋白质印迹法验证ANXA11的表达变化.结果:成功构建了pGPU6/GFP/Neo-ANXA11重组表达质粒,并筛选出单克隆细胞；RT-PCR及蛋白质印迹法检测结果表明,与空白对照组比较,重组质粒pGPU6/GFP/Neo-A11-Hca-F-1和2在mRNA水平,对ANXA11干扰率分别为(27.3±5.9)％和(58.3±12.4)％,P=0.001;在蛋白质水平,对ANXA11的下调率分别为(57.4±0.9)％和(87.1±6.1)％,P＜0.001；shRNA-2对ANXA11的表达抑制效果更为显著,P＜0.001.结论:成功建立了ANXA11表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株,为进一步研究ANXA11在淋巴转移中的作用奠定前期基础.
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ANXA11表达稳定下调的肝癌Hca-P细胞株的建立
目的构建针对膜联蛋白A11(Annexin A11,ANXA11) 的shRNA(small hairpin RNA),稳定转染小鼠低淋巴道转移力肝癌Hca-P细胞,筛选ANXA11稳定下调的单克隆细胞株,为后续研究奠定基础.方法 合成2条ANXA11的shRNA序列(shRNA-1和-2),与真核表达载体pGPU6/GFP/Neo连接,构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11表达载体并转染Hca-P细胞,通过G418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,Western blot检测Hca-P细胞ANXA11蛋白表达,并与空载体转染及对照组比较.结果成功构建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA- ANXA11重组表达质粒,并获得pGPU6/GFP/Neo- shRNA- ANXA11-Hca-P单克隆细胞株;shRNA-1重组质粒的抑制效果在mRNA和蛋白水平对ANXA11抑制率分别为80.2%和77.7%,P<0.01.结论 通过RNA干扰和基因转染技术成功建立了ANXA11表达稳定下调的Hca-P细胞株,得到了其单克隆细胞株,为进一步研究ANXA11在恶性肿瘤淋巴道转移中的作用及机制打下了基础.
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p.G38R和p.D40G突变通过改变ANXA11蛋白亚细胞定位引发肌萎缩侧索硬化症
目的 本研究旨在研究Annexin A11蛋白(ANXA 11)N端突变p.G38R和p.D40G对该蛋白亚细胞定位的影响,探索其引起肌萎缩侧索硬化症(ALS)的机制.方法 构建表达ANXA11野生型蛋白(wt)及p.G38R和p.D40G突变蛋白的真核表达载体,采用激光共聚焦显微镜检测3种蛋白在HEK293细胞中的亚定位.结果 ANXA11wt、p.G38R及p.D40G蛋白均可在HEK 293细胞中形成囊泡状结构,其中p.G38R组囊泡面积大于wt组(P =0.002)和p.D40G组(P=0.006),后两组间无明显差异(P =0.791).在单个细胞中,ANXA 11 wt形成的囊泡数目大于p.G38R组(P =0.002)和p.D40G组(P＜0.001),而P.G38R组和p.D40G组差异不明显(P=0.516).与ANXA 11 wt相比,p.G38R蛋白(P＜0.001)和p.D40G蛋白(P＜0.001)在细胞核内的分布显著减少,后两者间无明显差异(P=0.519).结论 p.G38R和p.D40G突变减少了ANXA 11蛋白相关囊泡状结构的数目和ANXA11蛋白在细胞核的分布,这可能是引起ALS发病的机制之一.
