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人脐血单个核细胞体外定向诱导向神经干细胞分化
背景:有文献报道应用不同的诱导剂如细胞生长因子和神经营养因子等,可将人脐血单个核细胞体外诱导为神经干细胞和,或成熟神经细胞,但诱导剂的使用方法以及剂量却备不相同.目的:联合应用不同的诱导剂将人脐血单个核细胞体外诱导分化为神经干细胞,并进行形态学观察和鉴定,以确定佳诱导剂组合及佳浓度.设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-05/2008-09在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成.材料:新鲜脐血来源于足月分娩的健康孕妇.方法:体外分离培养人脐血单个核细胞.在无血清DMEM/F12培养液中添加不同组合的诱导因子进行单个核细胞的诱导,以确定佳诱导因子组合:①10μ g/L神经生长因子(nerve growth factor,NGF)+体积分数为0.01神经营养因子N2+体积分数为0.02神经营养因子B27.⑦10μ g/LNGF+10μ g/L碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)+体积分数为0.01神经营养因子N2+体积分数为0.02神经营养因子B27.③10μ g/L bFGF+10μ g/L表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)+体积分数为0.01神经营养冈子N2+体积分数为0.02神经营养因子B27.④10μ g/LbFGF+10μ g/L EGF.同时在无血清DMEM/F12培养液中添加不同浓度的bFGF和EGF进行单个核细胞的诱导,以确定佳诱导浓度:①5μ g/L bFGF+5 μg/LEGF组.②10 μg/LbFGF和10 μg/L EGF组.③20μg/L bFGF和20μg/LEGF组.主要观察指标:①倒置荧光显微镜下观察脐血单个核细胞及各诱导剂组诱导分化为神经丁细胞的形态特征.②免疫荧光检测10 μ g/L bFGF和10μg/L EGF组神经干细胞巢蛋白nestin的表达情况.③流式细胞仪检测10μg/L.bFGF和10μg/L EGF组诱导第7天和第15天的细胞nestin衷达情况.结果:①分离培养的脐血单个核细胞呈散在的圆形牛长.②至诱导第7天,分化细胞出现突触样结构和生长端样结构,并可见多个细胞之间形成网络,符合神经干细胞样形态特征.③不同的细胞因子组合诱导的神经干细胞增殖和分化情况不同,含NGF实验组细胞长势相对差,含bFGF和EGF实验组的细胞长势旺盛,胞体较大而圆,细胞突起也粗大,呈三角形或锥形,突触样结构和牛长端样结构明显可见,为佳诱导因子组合.④010μg/L bFGF+10μ g/L EGF组的细胞密度适中,伸出突起明显,神经细胞形态特异,培养周期短,为适实验浓度.⑤细胞免疫荧光检测10μg/L bFGF+10μ g/L,EGF?组诱导第7天细胞nestin阳性.⑥流式细胞仪分别检测对照组和10μg/L bFGF+10μg/L EGF组诱导第7天、第15天nestin阳性细胞数,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论:联合应用 10μ g/L bFGF和10μ g/L EGF可较短时间内定向将人脐血单个核细胞体外诱导分化为神经干细胞.
关键词： 脐血单个核细胞 巢蛋白 碱性成纤维细胞生长因子 表皮牛长因子
