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体外纯化乳鼠许旺细胞的4种方法比较
背景:许旺细胞是外周神经系统中修复神经损伤及神经疾病的主要种子细胞之一.但是,许旺细胞的来源有限,且由于成纤维细胞的污染,使许旺细胞的纯度受到影响.有学者提出了其他的纯化方法,但每种方法都存在其不足之处而不能很好的满足临床应用的需要.目的:比较差速贴壁消化法、冷喷注法、磁珠分选法和G418筛选法4种体外纯化乳鼠许旺细胞方法的差异.方法:取SD大鼠坐骨神经得到所需神经组织.分别用差速贴壁消化法、冷喷注法、磁珠分选法和G418筛选法纯化许旺细胞.比较4种方法获得细胞的活力,免疫组织化学法鉴定许旺细胞并计算纯度.结果与结论:差速贴壁消化法所得到的细胞纯度稍低,活力尚可;冷喷注法获得的细胞纯度和活力均较高;磁珠分选法获得的细胞纯度和冷喷注法相当,但是活力稍差:G418筛选法活力差,纯度高.
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外源性sall4基因在胃癌HGC27细胞株中的表达及鉴定
目的:建立sall4稳定转染的HGC27细胞株,为sall4基因在胃癌发生发展中的作用研究奠定基础.方法:采用脂质体介导法将pCMV6-entry-sall4及pCMV6-entry质粒转染至HGC27细胞,48 h后加入终质量浓度600mg/L的G418抗生素进行药物加压筛选,获得阳性单克隆细胞株,通过RT-PCR和蛋白质印迹检测细胞中sall4的表达情况.结果:成功构建了稳定过表达sall4的HGC27细胞株,稳定转染细胞株中sall4的mRNA和蛋白水平明显高于未转染组及转染空载体组.结论:本实验成功筛选出sall4基因过表达的稳定转染胃癌细胞系.
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稳定表达绿色荧光蛋白的COS7细胞系的筛选和鉴定
目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的COS-7细胞系,为相关实验对照提供方便. 方法 常规方法培养COS-7细胞,将含pEGFP-N3基因的质粒转染COS-7细胞,G418抗性筛选,并用荧光显微镜进行跟踪检测,挑选耐药单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株. 结果 G418筛选的适浓度为500 μg/mL.筛选到的COS7 -GFP克隆荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光,细胞的生物学性状保持稳定,通过Western blot能检测到GFP蛋白. 结论 成功筛选并建立了稳定表达的COS7 -GFP细胞系.
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稳定沉默Beclin1的人成神经瘤SH-SY5Y细胞系的构建
为了构建pGenesil-1-Beclin1真核表达载体,并建立Beclin1稳定沉默的人成神经瘤SH-SY5Y细胞系,将合成的shRNA片段连接pGenesil-1质粒,构建成重组质粒pGenesil-1-Beclin1,转化其至感受态大肠杆菌JM109,挑取阳性克隆进行双酶切和DNA测序鉴定.常规培养SH-SY5Y细胞,将重组质粒pGenesil-1-Beclin1和空白对照质粒pGenesil-1转染SH-SY5Y细胞,G418抗性筛选,在荧光显微镜下挑取单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株,经RT-PCR和Western blot检测Beclin1基因的表达.经酶切和DNA测序鉴定重组真核表达载体构建正确,成功筛选出两株细胞系.和对照组转染pGenesil-1的细胞系相比,转染pGenesil-1-Beclin1细胞系的Beclin1 mRNA表达下降71.28％±1.45％ (P＜0.05),Beclin1蛋白表达下降75.50％±2.63％ (P＜0.05).提示已经成功构建pGenesil-1-Beclin1真核表达载体并建立了Beclin1基因稳定沉默的SH-SY5Y细胞系,为研究Beclin1功能提供了细胞模型.
