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藻酸盐凝胶三维培养条件下体外定向诱导骨髓间充质干细胞成软骨
背景:目前有关诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究不少,但选用何种生长因子调节以及如何保证其持续高效刺激尚处于探索阶段.目的:实验以软骨源性形态发生蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein 1,CDMP1)和转化生长因子β1(transforming growth factor-β 1,TGF-β1)作为主要诱导因子,通过三维培养微环境诱导,观察独立及联合应用时,促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化的能力.设计、时间及地点:体外观察实验,于2007-04/2008-04在辽宁医学院附属医院耳鼻喉实验室完成.材料:选择辽宁医学院附属第一医院自然流产或咪嗦流产的12-20周胚胎,胚胎的使用经孕妇同意.实验经医院医学伦理委员会批准.方法:无菌条件下取出胚胎股骨,用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化人胚骨髓间充质干细胞,体外培养传代.采用特定的诱导培养液使骨髓间充质干细胞向软骨分化,按培养基内添加生长因子的为同分成4组:①联合诱导组:无血清的软骨诱导液+CDMP1(300 μ g/L)+TGF-β1(10 μg/L).②TGF-β1诱导组:无血清的软骨诱导液+TGF-β1(10 μg/L).③CDMP1诱导组:无血清的软骨诱导液+CDMP1(300μ g/L).④对照组:无血清的软骨诱导液.先进行单层细胞培养10 d,再置干藻酸盐凝胶中继续培养11 d.主要观察指标:①于培养21 d后倒置显微镜观察细胞在凝胶球中的生长和增殖情况.②二甲基亚甲基蓝比色法测定各组标本的铵聚糖含量.③免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原的表达.结果:第21天后,倒置显微镜观察藻酸盐凝胶呈现透明胶冻状,有黏性.加入不同生长因子的藻酸盐凝胶,细胞呈散在分布于凝胶介质中,呈现"悬浮"状态.第21天时联合诱导组铵聚糖含量、Ⅱ型胶原表达阳性率高于其他3组,差异有显著性意义(P＜0.05);TGF-β1诱导组、CDMP1诱导组铵聚糖含量、Ⅱ型胶原表达阳性率高于对照组,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:骨髓间充质干细胞在三维培养条件下,TGF-β1和CDMP1联合作用促进骨髓间充质干细胞成软骨的作用明显.
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耻骨联合软骨细胞与藻酸盐凝胶复合物体内培养研究
目的 观察耻骨联合软骨细胞与藻酸盐凝胶支架复合物体内异位培养的情况.方法 从SD大鼠耻骨联合组织分离细胞体外培养后,按5×107/ml细胞密度与1.2%(w/v)低黏度海藻酸钠溶液混合,制备细胞凝胶复合物;再将细胞凝胶复合物植入裸鼠皮下,6周和12周后取材;通过HE、阿尔新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色,观察体内异位形成软骨的情况.结果 耻骨联合软骨细胞分散悬浮在凝胶支架中.6周和12周的裸鼠皮下标本见复合物中有新生的岛样组织出现,12周标本岛样组织明显增多,阿尔新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色显示岛样组织基质阳性显色.结论 耻骨联合软骨细胞与藻酸盐凝胶支架复合后,在体外仍然保持细胞活性,并且在裸鼠体内具有一定的异位软骨形成的能力.
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二维及三维培养对人舌鳞状细胞癌TCA8113细胞株生物学特性的影响
目的:比较二维及三维方式培养的人舌鳞状细胞癌(简称鳞癌)TCA8113细胞株对细胞的增殖、组织形态及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性的影响,为体外舌鳞癌的研究提供培养方法.方法:倒置显微镜和苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察二维及三维培养的人舌鳞癌TCA8113细胞的形态;噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法观察两种培养体系中细胞的增殖;酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测两种培养体系中LDH活性的改变.结果:倒置显微镜和HE染色观察到三维培养体系中TCA8113细胞成团生长;与二维培养体系比较,三维培养体系中细胞较长时间保持良好的增殖状态,LDH的活性较二维培养的细胞活性显著增高.结论:TCA8113细胞藻酸盐凝胶三维培养体系较二维培养体系能更好地体现细胞的生物学特性.
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藻酸钙为载体的可注射组织工程化骨行牙槽嵴增高术的实验研究
目的:研究以藻酸钙为载体的可注射组织工程化骨行牙槽嵴增高术的可行性.方法:通过穿刺方法从犬髂骨中抽取骨髓,体外分离、培养出骨髓基质成骨细胞,将骨髓基质成骨细胞与25 g/L藻酸钠溶胶混合形成藻酸钠-骨髓基质成骨细胞复合物,取其2 mL与0.07 g硫酸钙粉末混合均匀,注射于犬牙槽嵴顶部黏骨膜下,观察成骨情况,测量牙槽嵴增加高度.结果:藻酸钙-骨髓基质成骨细胞复合物植入犬牙槽嵴顶部黏骨膜下4周后有类软骨样组织形成,牙槽嵴增加高度(3.8±0.31)mm,8周时有骨小梁、骨髓腔等骨组织结构形成,增加牙槽嵴高度(2.9±0.15)mm.结论:以藻酸钙为载体的可注射性组织工程化骨在牙槽嵴增高术中有骨组织形成,但增加高度不足,有待改进.
