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腺病毒科/*遗传学文献资料
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小鼠脂联素重组腺相关病毒载体的构建
目的:构建脂联素重组腺相关病毒载体,为进一步研究脂联素的功能提供基础.方法:实验于2003年在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心进行.以带有小鼠脂联素基因的质粒pcDNA3.0-Ad为模板,聚合酶链反应克隆脂联素基因,并将聚合酶链反应扩增产物定向克隆于pAAV-MCS载体,重组AAV-MCS-Ad质粒经双酶切和测序鉴定.随后采用磷酸钙转染法将pAAV-MCS-Ad、pAAV-RC,pAAV-Helper质粒共转染AAV-293细胞,包装得到重组腺相关病毒(rAAV-Ad).回收病毒原液,采用PEG8000和氯仿纯化浓缩病毒.SDS-PAGE及透射电镜鉴定纯化的病毒,并采用Southern blot测定重组腺相关病毒的滴度.Western blotting检测rAAV-Ad转染H4ⅡE细胞后脂联素蛋白的表达.结果:①重组质粒AAV-MCS-Ad经双酶切和测序鉴定证实将脂联素基因已正确插入.②SDS-PAGE和电镜均证实rAAV-Ad病毒已构建成功.③Southern blotting测定病毒滴度约为约2.5×1014 L-1,通过rAAVLacZ转染细胞后X-gal染色计数,病毒的感染滴度在(0.83～1.2)×1010转导单位/mL.④Western blotting证实rAAV-Ad转染H4IIE细胞后在30 ku处见特异的阳性蛋白条带,证明能有效表达脂联素蛋白.结论:成功构建了携带小鼠脂联素基因的rAAV-Ad载体,经纯化浓缩后具有较好的纯度和较高滴度,能有效转染H4ⅡE细胞,并表达脂联素蛋白,具有良好的功能,为进一步研究其在真核细胞中的功能奠定了基础.
