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人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞向永生化细胞的转变
背景:颅神经嵴干细胞可以作为颌面部各种组织和器官分化研究的重要细胞来源,如何使其获得永生化具有重要意义.人类细胞自发永生化的频率非常低,而一些永生化的基因可以显著增加这种频率.目的:观察人端粒酶催化亚基基因在大鼠颅神经嵴干细胞永生化过程中的作用.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-09/2008-06在解放军第四军医大学完成.材料:选择清洁级孕8.5 d SD大鼠3只,6周,体质量180 g:先天性细胞免疫缺陷动物雄性Balb/c裸小鼠,体质量18～21 g,均由解放军第四军医大学实验动物中心提供.质粒PCIneo-hTERT由解放军第四军医大学口腔医院牙体牙髓科提供.方法:原代培养大鼠颅神经嵴干细胞后,将含有人端粒酶催化亚基基因的质粒PCIneo-hTERT转入大鼠颅神经嵴干细胞.经G418筛选后扩增,并连续培养.采用免疫细胞化学法观察转染细胞内人端粒酶催化亚基基因和颅神经嵴干细胞的特异标志物P75的表达,检测细胞的端粒酶活性,绘制细胞生长曲线观察其增殖能力,并通过裸鼠移植实验了解转染细胞的特性.主要观察指标:细胞克隆、特异性蛋白P75表达、端粒酶活性、增殖能力及致瘤性实验结果.结果:①质粒PCIneo-hTERT转染细胞后24 h,有少量细胞死亡.加G418后48 h,细胞逐步开始大量死亡.12 d后出现抗性细胞克隆,共有3个细胞克隆生长良好.分别命名为克隆1、2、3.克隆1和克隆2经过20～25代的传代后,细胞发生衰老、死亡;而克隆3在体外长期培养条件下生长状态良好,稳定表达人端粒酶催化亚基和P75.经转染后颅神经嵴干细胞的端粒酶活性明显升高,且能持续表达.②人端粒酶催化亚基基因转染后,3个细胞克隆在初期的增殖能力较强,随后克隆1、2的增殖速度逐渐变慢,出现死亡,克隆3越过衰老期,且无致瘤性.结论:人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞后,细胞得以永生化,其表型稳定,可作为颅颌面部细胞分化和组织工程研究的种子细胞.
