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慢病毒介导人神经营养素3基因在许旺细胞中的表达
背景:神经营养素3是目前发现的在脊髓损伤修复中作用强的神经营养因子,它能有效促进再生轴突穿越胶质瘢痕组织,从而修复脊髓损伤.目的:构建含有人神经营养素3基因的重组慢病毒载体(LV-hNT3),观察转染后人神经营养素3基因在许旺细胞中的表达.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-06/2008-03在长海医院中心实验室完成.材料:取新生3 d的SD乳鼠双侧坐骨神经,用于许旺细胞的培养及鉴定;慢病毒三质粒系统pGC-E1-EGFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0为上海吉凯基因化学技术有限公司产品.方法:通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGC-E1-hNT3-EGFP质粒,接着该质粒转化感受态的大肠杆菌E.coli DH5α,通过PCR及基因测序鉴定阳性克隆,再经Lipofectamine 2000将pGC-E1-hNT3-EGFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒系统共转染293T细胞包装病毒,按照病毒感染复数=1,4,8,10,12加入预先混好重组病毒完全培养液2 mL,通过增强型绿色荧光蛋白的表达测定收集的病毒滴度.将慢病毒转染许旺细胞,以未经转染的许旺细胞和经空载的慢病毒转染的许旺细胞为对照组.主要观察指标:慢病毒转染许旺细胞后,检测转染效率,通过实时荧光聚合酶链反应和蛋白免疫印迹检测人神经营养素3在许旺细胞中的表达.结果:实验中重组质粒的外源基因序列与GeneBank中的人神经营养素3阅读框架序列完全一致;浓缩后病毒滴度为5×107TU/L,LV-hNT3感染许旺细胞后,许旺细胞发出明亮的绿色荧光,当感染复数=10时转染效率高达85%,实时荧光PCR检测表明人神经营养素3 mRNA在入神经营养素3-许旺细胞中高效表达,而对照组中未表达,蛋白免疫印迹证实人神经营养素3在许旺细胞中表达.结论:实验构建的含有人神经营养素3基因的慢病毒载体能感染许旺细胞并且高效表达人神经营养素3.
