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重组人胶原绑定骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的表达、纯化与复性
目的：利用大肠杆菌表达体系制备带有胶原结合结构域（CBD）的骨形态发生蛋白2（BMP2），研究CBD-BMP2表达、纯化及复性的条件和方法。方法：将具有胶原结合能力的CBD基因序列克隆入 BMP2基因序列的 N端，构建重组蛋白表达质粒 pet21b／CBD-BMP2，转化入工程性大肠杆菌 BL21菌株内；37℃条件下添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）持续诱导表达；采用 Ni-NTA亲和层析柱进行纯化；运用超纯水稀释复性法对纯化后的CBD-BMP2进行复性；0.22μm微孔滤膜对复性后蛋白除菌，通过除菌前后蛋白浓度比值计算回收率；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测重组蛋白表达、纯化以及复性；BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。结果：重组质粒 pet21 b／CBD-BMP2在工程性大肠杆菌中得到充分表达；CBD-BMP2以包涵体形式表达；SDS-PAGE分析，8 mol·L－1尿素存在条件下目的蛋白溶解于裂解液上清中，经纯化后目的蛋白单体存在于洗脱液B中，单体相对分子质量约为14000；稀释复性后SDS-PAGE分析，相对分子质量14000及28000处可见2条清晰条带，重组蛋白单链成功复性为二聚体结构，相对分子质量约为28000；过滤除菌前后目的蛋白浓度分别为110和80 mg·L－1，回收率约为73％。结论：重组CBD-BMP2载体成功转化至大肠杆菌内，CBD-BMP2蛋白得到了高效的表达和复性。建立了利用原核表达体系制备重组CBD-BMP2蛋白的实验方法。
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胶原支架结合脑源性神经营养因子移植促进全横断脊髓损伤大鼠轴突再生及运动功能恢复的研究
目的 评价胶原支架结合脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)移植修复大鼠全横断脊髓损伤的效果.方法 将 32 只成年雌性 SD 大鼠随机分成 4 组(n=8):A 组为假手术组,只暴露T9、T10段脊髓;B、C、D 组切除长 4 mm 的 T9、T10段脊髓后,C、D 组分别于损伤处植入相应长度的线性有序胶原支架(linear ordered collagen scaffolds,LOCS)和结合了胶原结合结构域(collagen binding domain,CBD)-BDNF 的LOCS.术前及术后 3 个月内每周对大鼠进行 BBB 运动功能评分.术后 3 个月,实施神经电生理检测各组大鼠运动诱发电位(motor evoked potential,MEP);然后于 L2段脊髓组织注射荧光金(fluorogold,FG)实施逆行示踪, 1 周后取大鼠大脑及胸、腰段脊髓组织,脱水后观察脊髓组织形态;取包含损伤区的胸、腰段脊髓组织作切片.其中,脊髓冠状切片于激光共聚焦显微镜下进行观察,计算 FG 阳性细胞积分吸光度(IA)值;胸段脊髓组织水平切片采用免疫荧光染色,观察全横断脊髓损伤造模情况、脊髓损伤区轴突再生情况、D 组再生轴突的突触形成情况.结果 术后各时间点 B、C、D 组 BBB 评分均显著低于 A 组(P<0.05);术后 2～12 周 D 组 BBB 评分均明显高于 B、C 组(P<0.05).电生理检测示,B 组未观测到 MEP;C、D 组 MEP 潜伏期显著长于 A 组,C 组显著长于 D组,差异均有统计学意义(P<0.05).脊髓组织形态观察示,B 组脊髓损伤区域向两端延伸,损伤部位组织破坏严重;C、D 组脊髓形态恢复较好,D 组更接近正常组织形态.逆行示踪结果显示,各组大鼠损伤区以下的腰段脊髓灰质中均充满了 FG 阳性细胞;在损伤区以上的胸段脊髓中,A 组 FG 阳性区域 IA 值显著大于 B、C、D 组(P<0.05),C、D 组大于 B 组(P<0.05),C、D 组间差异无统计学意义(P>0.05).免疫荧光染色示,自同一脊髓背侧至腹侧选出的组织切片显示了明显异于正常组织的全横断脊髓损伤区域.A 组 NF 阳性轴突数明显多于 B、C、D 组,C、D 组多于 B 组,D 组多于 C 组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 LOCS 结合 CBD-BDNF 移植可以促进大鼠全横断脊髓损伤后轴突再生以及后肢运动功能恢复.
