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抗菌肽LfcinB与红色荧光蛋白mApple在酿酒酵母中的融合表达
目的 通过融合牛乳铁蛋白肽基因(bovine lactoferricin B,LfcinB)与红色荧光蛋白(mApple)基因,构建以mApple为报告基因的酵母表达载体,融合表达重组蛋白LfcinB-mApple,并进行活性检测.方法 取含LfcinB和mApple基因的pYES2-α-LfcinB-G13、pYES2-α-mApple-DP-AP质粒,分别经PCR扩增后连接形成片段LfcinB-mApple,插入质粒pYES2-α(质粒pYES2-α-LfcinB-G 13经双酶切所得)中,将构建的重组表达质粒pYES2-α-LfcinB-mApple转入酿酒酵母菌株W303,半乳糖诱导表达.管碟法检测表达的LfcinB-mApple对大肠埃希菌DH5α、金黄色葡萄球菌的抑菌活性;激光共聚焦检测红色荧光蛋白荧光的发射.结果 重组表达质粒pYES2-α-LfcinB-mApple经酶切鉴定和测序证明构建正确;表达的重组LfcinB-mApple对大肠埃希菌DH5α、金黄色葡萄球菌均有明显抑菌活性;重组酵母细胞内观察到红色荧光.结论 重组酿酒酵母成功分泌表达了具有生物活性的LfcinB-mApple,对进一步研究LfcinB的生物功能及大规模生产提供了条件.
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牛乳铁蛋白肽在酿酒酵母中的分泌表达及其活性
目的 在酿酒酵母中分泌表达牛乳铁蛋白肽(bovine lactoferricin,LfcinB),并检测其活性.方法 根据LfcinB的氨基酸序列,按照酿酒酵母密码子偏好性设计LfcinB基因序列,人工合成LfcinB基因,扩增后插入质粒pYES2-α中,构建重组表达质粒pYES2-α-LfcinB,转化至酿酒酵母INVSc1中,半乳糖诱导表达.采用抗生素微生物效价测定法中的管碟法一剂量法检测表达的LfcinB对大肠埃希菌DH5α和枯草杆菌的抑菌活性.对重组酵母菌的诱导时间、诱导剂浓度和诱导温度进行优化,并检测重组LfcinB的稳定性.结果 重组表达质粒pYES2-α-LfcinB经双酶切和测序证明构建正确;重组酵母菌诱导表达产物可见相对分子质量分别为5 164和4 355的特异蛋白条带,每升工程菌发酵液中目的蛋白含量约为2.878 5 mg;表达的重组LfcinB对大肠埃希菌DH5α和枯草杆菌均有明显的抑菌活性;在诱导温度为26℃、半乳糖浓度为3％的条件下诱导96 h时,LfcinB的抑菌活性高;重组LfcinB具有热稳定性,且二硫键的存在对其抑菌活性无影响.结论 已成功在酿酒酵母中分泌表达了具有活性的LfcinB,为进一步研究LfcinB的生物功能及其应用奠定了基础.
