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同源片段文献资料
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利用同源片段交换提高腈水合酶的热稳定性
目的 通过计算机辅助半理性设计对热不稳定的恶臭假单胞菌Psedomonas putida NRRL-18668腈水合酶(EC4.2.1.84,nitrile hydratase,简称NHase)分子进行改造,提高酶催化的热稳定性和活性.方法 以嗜热假诺卡菌Pseudonocardia thermophila JCM3095和睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosterone 5-MGAM-4DNHase作为模板,利用位点靶向氨基酸重组(site-targeted amino acid recombination,STAR)软件和分子动力学模拟分析选择合适的同源靶片段,通过同源交换替换Pseudomonas putida NRRL-18668NHase相应的片段,构建7株分别含有3种不同来源片段的新型杂合NHase,检测其热稳定性及活性;圆二色光谱分析野生酶和杂合酶3AB的二级结构.结果 7株杂合NHase (1A、2B、2C、2BC、3AB、3AC、3ABC)经50℃热处理10 min后,与野生型NHase相比,热稳定性分别提高了1.5～3.5倍,其中杂合NHase 3AB的热稳定性提高了3.5倍,酶活力提高了1.4倍;野生酶和杂合酶3AB二级结构中α螺旋含量分别为(34.56±3.21)％和(36.88±1.41)％,,β折叠含量分别为(19.78±3.21)％和(18.69±1.74)％.结论 通过利用热稳定性的同源片段来替换相应的热不稳定结构域这种理性设计的方法,成功将不耐热的NHase改造成耐热杂合NHase,同时提高了酶的比活力,并能维持NHase分子的基本二级结构不改变.
