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慢性粒细胞白血病ssDNA适配子PCR扩增条件的优化
目的 优化慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)ssDNA适配子的PCR扩增条件.方法 以合成的核苷酸适配子为模板并设计引物,根据引物解链温度(Tm值)设置不同的退火温度(38.0、39.2、41.2、44.2、48.3、51.5、53.6、55.0℃)、循环次数(12、16、20、24、28、30、35、38、40)及非限制性与限制性引物比例(1∶1、30∶1、50∶1、70∶1、80∶1、100∶1),进行PCR扩增,优化CML ssDNA适配子对称PCR及间接不对称PCR扩增条件,并验证优化的PCR条件的重复性.结果 对称PCR扩增的佳退火温度为44.2℃,佳循环次数为30次；间接不对称PCR的佳循环次数为38次,非限制性引物与限制性引物浓度比例为50∶1时,可获得理想的ssDNA和较少的dsDNA;优化的PCR条件重复性较好.结论 优化了CML ssDNA适配子的PCR扩增条件,为筛选到特异性的ssDNA适配子提供了参考,也为后续试验奠定了基础.
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指数级富集配体的系统进化技术筛选高转移肝癌细胞HCCLM3的ssDNA适配子
目的 采用指数级富集配体的系统进化(SELEX)技术筛选高转移肝癌细胞HCCLM3的ssDNA适配子.方法 构建长度为71 nt的随机文库,中间为25 bp的随机序列,通过12轮反复的SELEX筛选获得特异性结合HCCLM3细胞的ssDNA适配子,并初步测定筛选的适配子与细胞的亲和力,对结合力高的适配子进行克隆测序,用RNA struc-ture 5.3分析适配子序列的二级结构.结果 经过12轮正向筛选及6轮低转移肝癌细胞MHCC97-L的反筛后,获得了与HCCLM3细胞具有高亲和力的ssDNA适配子;将第12轮ssDNA经克隆测序获得10条测序结果,其中有4条序列一致,另外有2条序列也一致;二级结构预测可知ssDNA适配子二级结构主要以“发夹型”构型为主.结论 成功筛选获得了高亲和力的转移肝癌细胞HCCLM3 ssDNA适配子,为实现适配子靶向性治疗奠定了一定的理论基础.
关键词： 指数级富集配体的系统进化技术 肝癌细胞 ssDNA适配子
